汪琪云 尹利 陳英

(重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院麻醉科，重慶 402260)

胃癌5年總生存率低于30%，是一個相當(dāng)大的健康負擔(dān)[1-2]。目前，外科手術(shù)仍然是臨床治療胃癌的重要手段，而圍術(shù)期過程中所用到的麻醉藥與術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移存在著復(fù)雜關(guān)聯(lián)[3]。丙泊酚是一種常用的靜脈注射麻醉藥，不僅具有誘導(dǎo)或維持全身麻醉的作用，還有著潛在的抗腫瘤作用[4-5]。有研究[6-7]指出，丙泊酚可通過抑制細胞增殖、侵襲和遷移抑制胃癌惡性進展，但具體的機制并不完全明確。越來越多的研究[8-9]顯示，丙泊酚的抗腫瘤作用與其調(diào)控的微小RNA(microRNA，miRNAs)有著密切關(guān)系。miR-547-5p是miRNAs家族成員，被證實在胃癌組織中異常高表達，與腫瘤大小、分期和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。同時，有研究[11]指出，丙泊酚可通過下調(diào)神經(jīng)元中miR-547-5p的表達發(fā)揮治療作用。然而丙泊酚能否通過調(diào)控miR-547-5p表達影響胃癌細胞的生物學(xué)行為尚未可知。為此，本研究通過體外細胞實驗探討丙泊酚抑制胃癌細胞增殖、侵襲和遷移的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人胃癌細胞株AGS(中科院上海細胞庫)；胎牛血清、洛斯維公園紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)-1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶(美國Gibco)；青霉素、鏈霉素和引物(上海生工生物工程)；LipofectamineTM2000和cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen)；性別決定區(qū)Y框蛋白2(Sex-determining region of Y chromosome-related high-mobility-group box 2，SOX2)抗體和β肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Abcam)；辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋)；miR-574-5p模擬物和陰性對照、SOX2小干擾RNA及其對照、SOX2過表達質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒(廣州銳博生物)；細胞計數(shù)(Cell Counting Kit-8，CCK-8)試劑盒(北京索萊寶)；雙熒光素酶活性檢測試劑盒(美國Promega)；Trizol試劑、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、全功能多波長酶標(biāo)儀和二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)儀(美國ABI)；Transwell小室(美國Corning)；倒置顯微鏡和紫外可見分光光度計(上海譜元儀器)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 AGS細胞培養(yǎng) 采用含10 mg/mL鏈霉素、10 kU/mL青霉素和100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在條件為溫度37 ℃、濕度飽和、50 mL/L二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)AGS細胞。待細胞密度達80%左右時，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，并以1:2比例傳代。實驗所用細胞為生長良好的第3～5代對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 AGS細胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的AGS細胞按照每孔106個接種至6孔細胞板上，分別加入不同濃度(0、5、10、20 μg/mL)的丙泊酚處理48 h，依次記為0 μg/mL組、5 μg/mL組、10 μg/mL組、20 μg/mL組，按照下述實驗步驟檢測細胞存活率、克隆形成率、遷移和侵襲細胞數(shù)、miR-574-5p和SOX2表達水平，確定丙泊酚使用濃度。將AGS細胞接種6孔細胞板，待細胞匯合度達70%以上時，參照LipofectamineTM2000說明書步驟將miR-NC、miR-574-5p模擬物、si-con、si-SOX2、miR-574-5p模擬物+pcDNA、miR-574-5p模擬物和pcDNA-SOX2分別轉(zhuǎn)染AGS細胞，轉(zhuǎn)染48 h后給予20 μg/mL丙泊酚處理24 h，依次標(biāo)記為丙泊酚+miR-NC組、丙泊酚+miR-574-5p組、丙泊酚+si-con組、丙泊酚+si-SOX2組、丙泊酚+miR-574-5p+pcDNA組和丙泊酚+miR-574-5p+pcDNA-SOX2組，同時設(shè)置對照組(未處理)、丙泊酚組(加入20 μg/mL丙泊酚處理48 h)。其中每組設(shè)置3個復(fù)孔。給藥結(jié)束后，收集各組細胞，按照下述實驗步驟檢測miR-574-5p和SOX2蛋白表達、細胞存活率、克隆形成率、遷移和侵襲細胞數(shù)。

1.2.3 CCK-8法檢測AGS細胞增殖 將各組AGS細胞以每孔1×104個接種至96孔板上后，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。其中每個處理設(shè)置3個復(fù)孔。同時以無細胞的培養(yǎng)液作為空白調(diào)零組。每孔加入CCK-8溶液10 μL，孵育4 h后，上酶標(biāo)儀檢測細胞在490 nm波長處的吸光度值，并按照(實驗組吸光度值-空白組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%公式計算各組細胞的存活率。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 平板克隆形成實驗檢測AGS細胞克隆形成能力 收集各組AGS細胞，吹打制成單細胞懸液；以含血清培養(yǎng)基進行梯度稀釋，分別以50、100和200個細胞梯度接種至10 mL的培養(yǎng)皿中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14～21 d；待出現(xiàn)肉眼可見集落時，終止培養(yǎng)。棄培養(yǎng)液，以磷酸緩沖液洗滌細胞2次。以4%多聚甲醛固定20 min后，0.1%結(jié)晶紫染色15 min。洗去染色液，空氣干燥后，采用顯微鏡觀察各組細胞的克隆形成情況，其中以大于10個細胞的集落作為一個有效克隆，以克隆數(shù)與接種細胞數(shù)的百分比表示各組細胞的克隆形成率。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell小室檢測AGS細胞侵襲與遷移 ①侵襲實驗：在實驗前，將基質(zhì)膠按照1∶3比例以無血清培養(yǎng)基稀釋后，取50 μL平鋪于Transwell小室聚碳酸酯膜表面上，室溫下充分融合。收集各組AGS細胞，制備濃度為105個/mL的細胞懸液。將基質(zhì)膠包被后的Transwell小室放入24孔細胞板上，其中小室下室中加有600 μL含血清培養(yǎng)基，在小室上室內(nèi)加入200 μL細胞懸液。放入細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將小室小心取出，以棉簽輕輕拭去未穿膜的細胞后，分別以4%多聚甲醛和0.1%結(jié)晶紫對細胞進行固定與染色。洗去染色液后，采用顯微鏡觀察統(tǒng)計隨機選取的3個視野內(nèi)的穿膜細胞數(shù)目，結(jié)果取均值。實驗重復(fù)3次。②遷移實驗：實驗步驟與侵襲實驗基本相同，只是不需要對Transwell小室聚碳酸酯膜進行包被。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測AGS細胞中miR-574-5p的表達 采用Trizol法提取AGS細胞總RNA后，采用紫外分光光度計檢測RNA的濃度。將高質(zhì)量的RNA參照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA后，以cDNA作為模板上PCR儀進行擴增。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算AGS細胞中miR-574-5p的表達水平。實驗重復(fù)3次。其中，PCR引物序列如下：miR-574-5p上游：5′-GGGGTGAGTGTGTGT GTG-3′，下游：5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6 上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AA CGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸10 s，循環(huán)40次；72 ℃總延伸5 min。

1.2.7 免疫印跡法檢測AGS細胞中SOX2蛋白的表達 采用放射免疫沉淀法提取AGS細胞總蛋白后，參照BCA檢測試劑盒說明書檢測總蛋白的濃度與純度。將熱變性后的蛋白樣品按照每孔80 μg上樣至10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠孔中行電泳分離。電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯上。5%脫脂奶粉封膜2 h后，加入按照1∶1 000比例稀釋的SOX2和β-actin抗體室溫孵育2 h；再以按照1∶2 000比例稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1.5 h。經(jīng)化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光后，以β-actin為內(nèi)參，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析AGS細胞中SOX2蛋白的表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-574-5p與SOX2的靶向關(guān)系 采用TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測到miR-574-5p與SOX2 3′非翻譯區(qū)(Untranslated Region，UTR)存在互補的結(jié)合位點。將SOX2 3′UTR片段克隆擴增至熒光素酶載體上，構(gòu)建SOX2野生型(SOX2-WT)載體；另外，將miR-574-5p與SOX2 3′UTR結(jié)合位點定點突變后克隆重組到熒光素酶載體上，作為SOX2突變型(SOX2-MUT)載體。將SOX2-WT、SOX2-MUT載體參照脂質(zhì)體2000說明書步驟分別與miR-574-5p模擬物及其陰性對照(miR-NC)共轉(zhuǎn)染至AGS細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，參照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測AGS細胞的熒光酶活性。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚抑制胃癌AGS細胞增殖、侵襲和遷移 與0 μg/mL組比較，5、10和20 μg/mL丙泊酚處理組細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均明顯降低(P<0.05)，且呈濃度依賴性，見表1。

表1 各組細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)的比較Table 1 Comparison of cell survival rate,clone formation rate,invasive cell number and migrating cell number in each group

2.2 丙泊酚下調(diào)胃癌AGS細胞中miR-574-5p表達且上調(diào)SOX2蛋白表達 與0 μg/mL組比較，5、10和20 μg/mL丙泊酚處理組細胞中miR-574-5p表達水平呈濃度依賴性降低，而SOX2蛋白的表達水平呈濃度依賴性升高(P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 免疫印跡法檢測各組細胞中SOX2蛋白表達Figure 1 Detection of Sox2 protein expression in cells of each group by Western blot

表2 各組細胞中miR-574-5p和SOX2蛋白表達水平的比較Table 2 Comparison of mir-574-5p and Sox2 protein expression levels in cells of each group

2.3 SOX2是miR-574-5p的潛在靶基因 miR-574-5p與SOX2 3′UTR存在互補的結(jié)合位點；miR-574-5p模擬物與SOX2-WT共轉(zhuǎn)染后細胞的熒光素酶活性較相應(yīng)對照miR-NC組明顯降低(P<0.05)；但miR-574-5p模擬物與SOX2-MUT共轉(zhuǎn)染后細胞的熒光素酶活性與miR-NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2、表3。

圖2 miR-574-5p和SOX2 3′UTR存在互補的結(jié)合位點Figure 2 Complementary binding sites of mir-574-5p and Sox2 3′UTR

表3 各組細胞熒光素酶活性的比較Table 3 Comparison of luciferase activity in each group

2.4 上調(diào)miR-574-5p表達或下調(diào)SOX2表達逆轉(zhuǎn)丙泊酚對胃癌AGS細胞細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與對照組比較，丙泊酚組AGS細胞中miR-574-5p的表達水平明顯降低，而SOX2蛋白的表達水平明顯升高，細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均明顯降低(均P<0.05)；丙泊酚+miR-NC組AGS中miR-574-5p和SOX2蛋白表達水平、細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)與丙泊酚組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；與丙泊酚組或丙泊酚+miR-NC組比較，丙泊酚+miR-574-5p組AGS細胞中miR-574-5p表達水平明顯升高，SOX2蛋白的表達水平明顯降低，細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均明顯升高(均P<0.05)。與丙泊酚+si-con組比較，丙泊酚+si-SOX2組AGS細胞中miR-574-5p表達水平明顯升高，SOX2蛋白的表達水平明顯降低，細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均明顯升高(均P<0.05)，圖3、表4。

表4 各組細胞中miR-574-5p和SOX2蛋白表達水平的比較Table 4 Comparison of mir-574-5p and Sox2 protein expression levels in cells of each group

圖3 免疫印跡法檢測各組細胞中SOX2蛋白的表達Figure 3 Detection of Sox2 protein expression in cells of each group by Western blot

2.5 上調(diào)SOX2表達逆轉(zhuǎn)miR-574-5p對丙泊酚處理的胃癌AGS細胞增殖、侵襲和遷移的影響 與丙泊酚+ miR-574-5p+pcDNA組比較，丙泊酚+miR-574-5p+pcDNA-SOX2組AGS細胞SOX2蛋白表達、細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均明顯升高(均P<0.05)，見圖4、表5。

表5 各組細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)的比較Table 5 Comparison of cell survival rate,clone formation rate,invasive cell number and migrating cell number in each group

圖4 免疫印跡法檢測各組細胞中SOX2蛋白的表達Figure 4 Detection of Sox2 protein expression in cells of each group by Western blot

3 討論

麻醉是手術(shù)過程中不可或缺的一部分，作為常用的靜脈注射麻醉藥，丙泊酚在腫瘤手術(shù)過程中的作用逐漸引起關(guān)注。異丙酚通過抑制解整合素樣金屬蛋白酶8(a disintegrin and metalloprotease domain 8，ADAM8)表達可抑制胰腺癌細胞增殖、遷移，且皮下注射異丙酚可抑制異種移植瘤形成[12]。丙泊酚通過調(diào)控miR-133a/性別決定區(qū)Y框蛋白4(sex-determining region Y-box 4，SOX4)的表達還可抑制結(jié)直腸癌HCT116細胞增殖并促進其凋亡[13]。在乳腺癌中，丙泊酚可通過下調(diào)miR-24表達誘導(dǎo)MDA-MB-435細胞凋亡[14]；此外，丙泊酚還在改善乳腺癌改良根治術(shù)后復(fù)發(fā)方面起到了積極作用[15]。目前，已有研究[16]指出丙泊酚具有抑制胃癌細胞增殖、侵襲和遷移的作用，但具體的作用機制并不完全清楚。

miRNAs是一類內(nèi)源性非編碼微小RNA，長度在22個核苷酸左右，可通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達，影響細胞生物學(xué)功能，參與包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17-18]。miR-574-5p是miRNAs中的重要一員，在甲狀腺乳頭狀癌和宮頸癌等腫瘤中異常高表達，且發(fā)揮著重要的促癌作用[19-20]。本研究除發(fā)現(xiàn)丙泊酚可抑制胃癌AGS細胞的存活、克隆形成、遷移和侵襲外，還發(fā)現(xiàn)丙泊酚可呈濃度依賴性下調(diào)AGS細胞中miR-574-5p的表達。這提示miR-574-5p可能在丙泊酚抗胃癌過程中扮演著重要角色。SOX2是性別決定區(qū)Y框蛋白基因家族成員，除了參與胚胎發(fā)育和性別決定外，其異常表達還與喉癌、大腸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[21-22]。有研究[23]指出，SOX2在胃癌組織中異常低表達，且在細胞增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚作用后胃癌AGS細胞中SOX2蛋白的表達水平呈濃度依賴性升高。這提示，SOX2可能在丙泊酚抗胃癌過程中發(fā)揮著重要作用。本研究采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測到miR-574-5p與SOX2 3′UTR區(qū)域存在互補的結(jié)合位點；同時，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實SOX2是miR-574-5p的潛在靶基因。上調(diào)miR-574-5p表達可明顯逆轉(zhuǎn)丙泊酚對AGS細胞SOX2蛋白表達的促進作用。此外，上調(diào)miR-574-5p表達或下調(diào)SOX2表達均可逆轉(zhuǎn)丙泊酚對AGS細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用，且過表達SOX2還可逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-574-5p表達對丙泊酚處理的AGS細胞增殖、侵襲和遷移的影響。這提示，丙泊酚可通過下調(diào)miR-574-5p表達進而引起其靶基因SOX2表達升高發(fā)揮抗胃癌的作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，丙泊酚可通過調(diào)控miR-574-5p/SOX2表達抑制胃癌AGS細胞增殖、侵襲和遷移，該結(jié)果有望為丙泊酚成為胃癌手術(shù)治療中的理想麻醉藥提供新的實驗依據(jù)。