王劍文 孫丹 馮雁明

(1.武漢市金銀潭醫(yī)院呼吸結(jié)核科,湖北 武漢 430062；2.武漢市金銀潭醫(yī)院血管介入科,湖北 武漢 430062；3.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院,湖北 武漢 430070)

肺癌是世界上癌癥死亡的首要原兇。肺癌的治療主要根據(jù)癌癥的亞型和分期來決定，近年來，針對癌癥亞型的個性化靶向治療也越來越多的應(yīng)用于肺癌的治療[1-3]。lncRNA(long non-coding RNA)可調(diào)控非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]。有研究表明，lncRNALINC00987在肺腺癌中明顯低表達，與患者的總生存期降低有關(guān)[6-7]，但其具體作用機制尚不清楚。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)LINC00987與miR-375存在結(jié)合位點。miR-375在NSCLC細(xì)胞中高表達，其高表達可增強NSCLC細(xì)胞的侵襲、遷移能力[8]。LINC00987和miR-375在肺癌中是否存在調(diào)控關(guān)系還不清楚。本研究以肺癌細(xì)胞A549為主要研究對象，假設(shè)LINC00987通過靶向miR-375調(diào)控A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并對此假設(shè)進行驗證，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肺癌細(xì)胞株A549、HCC827、H1299細(xì)胞購自ATCC，正常肺泡上皮細(xì)胞HPAEPIC購自北納生物；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司，牛血清白蛋白(Bovine Serun Albumin,BSA)和胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell板購自美國Corning公司；引物、LINC00987過表達載體(pcDNA-LINC00987)、LINC00987小干擾RNA(si-LINC00987)、miR-375 mimics(miR-375)、miR-375 inhibitors(anti-miR-375)、陰性對照(pcDNA-control、si-control、miR-control和anti-miR-control)、LINC00987野生型(WT)和突變型(MUT)雙熒光素酶報告系統(tǒng)載體購自上海吉瑪制藥有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Total RNA提取試劑盒、real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購自寶生物工程(大連)有限公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自美國Promega公司；光學(xué)顯微鏡、全自動酶標(biāo)儀、發(fā)光儀及Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測LINC00987表達量 以正常肺泡上皮細(xì)胞HPAEPIC為對照，qRT-PCR檢測肺癌細(xì)胞株A549、HCC827和H122P細(xì)胞中LINC00987表達量，選擇表達量差異較大的A549細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 配制含10 % FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，將人肺癌細(xì)胞株A549、HCC827、H1299和正常肺泡上皮細(xì)胞HPAEPIC均培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中，在飽和濕度、37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，消化傳代。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞稀釋后以2×105個細(xì)胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至融合度達80%，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組：pcDNA-control組、pcDNA-LINC00987組、LINC00987(WT)+miR-control組、LINC00987(WT)+miR-375組、LINC00987(MUT)+miR-control組、LINC00987(MUT)+miR-375組、si-control組、si-LINC00987組、miR-control組、miR-375組、anti-miR-375組、anti-miR-control組、pcDNA-LINC00987+miR-control組和pcDNA-LINC00987+miR-375組，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞進行驗證，驗證無誤進行后續(xù)實驗。

1.2.4 Real-timePCR檢測RNA的表達 收集肺癌細(xì)胞株A549、HCC827、H1299和正常肺泡上皮細(xì)胞HPAEPIC，使用Total RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，參照 real-time PCR試劑盒說明書進行反應(yīng)合成miR-375和LINC00987，反應(yīng)程序為：95 ℃ 1 min；94 ℃ 40 s、59 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，45個循環(huán)；72 ℃ 5 min。用2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 CCK8實驗檢測細(xì)胞增殖 收集轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞(pcDNA-LINC00987組和pcDNA-LINC00987+miR-375組及對照組)，消化細(xì)胞并用培養(yǎng)液稀釋，以2×103個細(xì)胞/孔(200 μL/孔)接種于96微孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)至24、48、72 h進行 CCK8實驗，每孔加入10 μL CCK8溶液，然后37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h，上酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度(A)值。

1.2.6 Transwell實驗測定細(xì)胞侵襲和遷移 遷移實驗：將轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細(xì)胞，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基過夜饑餓培養(yǎng)，然后培養(yǎng)液稀釋至1×106個細(xì)胞/mL，取100 μL稀釋后的A549細(xì)胞加入Transwell上層小室，下層小室加入500 μL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基作為遷移趨化物，培養(yǎng)24 h，取出后用棉簽拭去上層小室未遷移的細(xì)胞，冰甲醛固定遷移細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，拍照，顯微鏡計數(shù)，取10個視野，計算平均值。侵襲實驗：將Matrigel置4 ℃冰箱過夜液化，用4 ℃無血清培養(yǎng)基1∶5比例稀釋Matrigel，取100 μL加入Transwell上層小室，37 ℃ 3～5 h使其固態(tài)化，其余步驟同遷移實驗。

1.2.7 雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗 根據(jù)1.2.3進行A549細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建好的LINC00987野生型(WT)和突變型(MUT)雙熒光素酶報告載體與miR-control或miR-375共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液重懸細(xì)胞，4 ℃裂解細(xì)胞過夜，離心收集上清，檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為對照，分析螢火蟲熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 LINC00987在肺癌細(xì)胞株中低表達 與正常肺泡上皮細(xì)胞HPAEPIC相比，在肺癌A549、HCC827和H1299細(xì)胞中LINC00987表達量均顯著降低(P<0.05)(表1)。LINC00987在三種肺癌細(xì)胞株中表達情況一致，選擇表達差異較大的A549細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

表1 qRT-PCR檢測不同肺癌細(xì)胞株中LINC00987的表達Table 1 Expression levels of LINC00987 in different lung cancer cell lines were detected by qRT-PCR

2.2 過表達LINC00987抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖、侵襲和遷移 與pcDNA-control組相比，pcDNA-LINC00987組A549細(xì)胞中LINC00987表達量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞OD值在24、48和72h均顯著降低(P<0.05)，侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均顯著下降(P<0.05)，說明過表達LINC00987可抑制A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，見圖1、表2。

圖1 過表達LINC00987抑制A549細(xì)胞的侵襲和遷移Figure 1 Over-expression of LINC00987 inhibited the invasion and migration of A549 cells

表2 過表達LINC00987抑制A549細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移Table 2 Effect of over-expression of LINC00987 on proliferation,invasion and migration of A549 cells cells

2.3 LINC00987靶向抑制miR-375的表達 通過LncBase網(wǎng)站預(yù)測到miR-375與LINC00987 可能存在結(jié)合位點(圖2)；雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，與LINC00987(WT)+miR-control組相比，LINC00987(WT)+miR-375組熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)，LINC00987(MUT)+miR-control組和LINC00987(MUT)+miR-375組熒光素酶活性無變化(P>0.05)(表3)；與pcDNA-control組相比，pcDNA-LINC00987組A549細(xì)胞中miR-375表達顯著下降(P<0.05)；與si-control組相比，si-LINC00987組A549細(xì)胞中miR-375表達顯著上升(P<0.05)，見表4。

圖2 LINC00987與miR-375的結(jié)合位點Figure 2 The binding site of LINC00987 to miR-375

表3 雙熒光素酶活性檢測A549細(xì)胞中LINC00987與miR-375的靶向關(guān)系Table 3 The targeting relationship between LINC00987 and miR-375 in A549 cells was validated by double luciferase activity

表4 qRT-PCR檢測A549細(xì)胞中LINC00987的表達對miR-375表達的影響Table 4 The effect of LINC00987 expression on the expression of miR-375 in A549 cells was determined by qRT-PCR

2.4 miR-375對A549細(xì)胞的影響 與miR-control組相比，miR-375組A549細(xì)胞中miR-375表達量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞OD值在48、72h均顯著升高(P<0.05)，侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P<0.05)；與anti-miR-control組比較，anti-miR-375組A549細(xì)胞中miR-375表達量顯著減少(P<0.05)，細(xì)胞OD值在48、72 h均顯著降低(P<0.05)，侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均顯著下降(P<0.05)。說明過表達miR-375可促進A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，敲減miR-375可抑制A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，見表5。

表5 miR-375對A549細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移的影響Table 5 Effect of miR-375 on proliferation,invasion and migration of A549 cells cells

2.5 miR-375阻斷LINC00987對A549細(xì)胞的抑制 為確認(rèn)LINC00987是否通過miR-375調(diào)控A549細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，在過表達LINC00987的同時過表達miR-375。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與pcDNA-LINC00987+miR-control組相比，pcDNA-LINC00987+miR-375組miR-375表達升高(P<0.05)，細(xì)胞OD值、侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P<0.05)。說明過表達miR-375可阻斷過表達LINC00987對A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制，見表6。

表6 過表達miR-375阻斷過表達LINC00987對A549細(xì)胞的抑制作用Table 6 Over-expression of miR-375 blocked the inhibitory effects of LINC00987 over-expression on A549 cells

3 討論

研究表明，多種lncRNA 和miRNA在肺癌中表達異常，通過多種機制調(diào)控癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等過程，是肺癌的診斷、預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，在靶向治療中也有很大的價值[9-12]。Salavaty A等[6]研究表明，lncRNA LINC00987在肺腺癌中低表達，可能是抑瘤基因，其表達水平與肺腺癌患者的總生存期有關(guān)[7]。關(guān)于LINC00987的研究較少。有研究通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤樣本中，LINC00987低表達的患者生存率顯著提高，其在高危組樣本中水平顯著升高[13]。有研究構(gòu)建了慢性阻塞性肺病(COPD)差異表達的miRNA-mRNA-lncRNA網(wǎng)絡(luò)，通過qRT-PCR對其進行驗證，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，LINC00987在非吸煙COPD患者中表達下調(diào)，可能與miR-122-5p、A2M-as1和linc00612一起通過調(diào)控A2M(α2-巨球蛋白)參與COPD[14]。本研究結(jié)果表明，與對照相比，LINC00987在肺癌A549、HCC827和H1299細(xì)胞中表達均顯著下調(diào)，與Salavaty A等[6]研究結(jié)論一致，過表達LINC00987可抑制A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，說明LINC00987在肺癌的發(fā)展中起重要作用。

本研究通過LncBase網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)，LINC00987和miR-375存在結(jié)合位點，因此假設(shè)LINC00987靶向miR-375調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。miR-375最初發(fā)現(xiàn)于胰島β細(xì)胞內(nèi)，參與胰島發(fā)育、穩(wěn)定葡萄糖水平、粘膜免疫和肺表面活性物質(zhì)分泌，也參與多種癌癥發(fā)生[15-16]。miR-375在胃癌[17]、肝癌細(xì)胞[18]中表達明顯下調(diào)，靶向YAP1-TEAD4-CTGF軸參與Hippo通路抑制胃癌，靶向ErbB2(受體酪氨酸蛋白激酶erbB-2)抑制人肝癌細(xì)胞生長和調(diào)控細(xì)胞凋亡。miR-375在前列腺腫瘤和患者血漿中表達上調(diào)，可能通過ZEB1-miR-375-YAP1調(diào)控回路抑制EMT和癌細(xì)胞的侵襲遷移[19]。在肺癌中，有研究發(fā)現(xiàn)miR-375在肺腺癌和小細(xì)胞肺癌中表達顯著上調(diào)，在鱗狀細(xì)胞癌中表達下調(diào)，在小細(xì)胞肺癌中靶向ITPKB促進小細(xì)胞肺癌的生長[20]。Chen W J等[21]研究也表明，miR-375在肺鱗癌組織中表達顯著降低，具有抑癌作用。本研究中，miR-375可促進A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，而敲減其表達具有相反的結(jié)果。通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)及同時過表達miR-375和LINC00987發(fā)現(xiàn)，LINC00987靶向miR-375并可抑制miR-375的表達；過表達miR-375可阻斷過表達LINC00987對A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用，證實了兩者在肺癌中存在調(diào)控關(guān)系，與上述研究結(jié)果共同證實miR-375在肺癌發(fā)展中的重要作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，在肺癌A549細(xì)胞中，lncRNA LINC00987通過靶向miR-375調(diào)控A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，過表達LINC00987可抑制miR-375表達進而抑制肺癌生長和轉(zhuǎn)移。LINC00987是肺癌的潛在分子靶點。