申豐銘，楊紹杰，王 娟，朱國旗

(安徽中醫(yī)藥大學新安醫(yī)學教育部重點實驗室，合肥 230038)

神經生物學是當今生物科學界重點關注的學科，也是生命科學的前沿，涵蓋神經科學及其相關的生物研究領域，與人類健康息息相關。神經生物學從分子、細胞、突觸連接、環(huán)路等多個層面對生物體神經系統(tǒng)進行研究，而神經系統(tǒng)的研究須借助各種先進的現(xiàn)代技術，如：在體電生理可以記錄特定腦區(qū)的神經元放電和局部場電位；膜片鉗技術可以檢測單個細胞，甚至是單個離子通道的電勢變化；光遺傳學(Optogenetics)和光纖記錄等可以研究特定細胞群的活動。這些技術都能夠使復雜的生物學機制直觀地展現(xiàn)出來。

光遺傳學是近年來迅速崛起的一項生物工程技術，它涵蓋了光學、軟件控制、基因操作技術、電生理等多種技術手段，在現(xiàn)代神經生物學中應用廣泛，尤其在神經環(huán)路、生物行為、中樞神經系統(tǒng)疾病及精神疾病的機理研究中發(fā)揮著重要作用[1]。光遺傳學的主要原理是利用分子生物學、病毒生物學等手段，將外源光敏蛋白基因導入活體動物神經細胞中，在細胞膜上表達出光敏蛋白，然后通過特定波長的光照射，控制細胞膜上光敏蛋白的激活與抑制，進而控制細胞膜上離子通道的開放與閉合，改變細胞膜電壓的變化，如膜的去極化與超極化，以達到對細胞選擇性興奮或抑制的目的。

1 神經生物學熱點研究現(xiàn)狀

在神經生物學大學科中，有許多熱門的研究領域，包括疼痛-情緒共病、應激與免疫、獎賞與藥物成癮、認知功能、睡眠與覺醒等。與會專家分別就各自研究領域進行了深入探討。

1.1 疼痛-情緒共病

痛覺是生物機體的一種保護機能，當機體產生痛覺時，實則是機體的保護警示，但當疼痛長期存在的時候，如癌痛、偏頭痛和三叉神經痛等慢性疼痛，可能會導致焦慮和抑郁的發(fā)生，而抑郁癥患者也普遍存在軀體疼痛，最終形成疼痛-情緒共病，且發(fā)生機制尚不明確。張智課題組運用光遺傳學和病毒示蹤等技術在疼痛與抑郁、焦慮兩個方面的神經環(huán)路開展了一系列研究，發(fā)現(xiàn)杏仁核作為重要腦區(qū)參與了疼痛-情緒行為反應，其中疼痛與抑郁之間的神經環(huán)路研究包括中央杏仁核(CeA)-外側僵核神經環(huán)路介導慢性疼痛→抑郁[2]、CeA-丘腦束旁核神經環(huán)路介導抑郁→疼痛[3]、CeA神經環(huán)路驅動抑郁→疼痛的內源鎮(zhèn)痛系統(tǒng)[4]；疼痛與焦慮的神經環(huán)路機制研究包括CeA神經環(huán)路介導疼痛→焦慮[5-6]。通過上述研究發(fā)現(xiàn)，疼痛-情緒之間存在神經環(huán)路的交互作用，CeA可能在疼痛-情緒共病中起“橋梁”作用。這一系列的研究對探索慢性疼痛和焦慮、抑郁等情緒共病的發(fā)病機制具有重要意義，可能為藥物不敏感患者提供非藥物治療方法，如經顱磁刺激緩解強迫癥導致的焦慮等[7]。

1.2 應激與免疫

應激是一種機體接受外界刺激后增加活動力量從而應對緊急情況的一個過程，但過度應激會引起一系列精神情志疾病[8]。首先針對獎賞和應激之間的關系進行研究，通過光遺傳學實驗探索小鼠腦內室旁核CRH神經元的活動，該研究揭示了應激與獎賞整合的一個新的神經機制，室旁核CRH神經元可以被獎賞活動強烈抑制而緩解壓力[9]。另一項研究聚焦于神經和免疫。神經和免疫系統(tǒng)如何交互作用一直是困擾人們的重大科學問題，胡霽課題組通過偽狂犬病毒逆行追蹤，發(fā)現(xiàn)脾神經與室旁核(PVN)和CeA之間存在神經連接，進一步運用光遺傳學技術開展實驗發(fā)現(xiàn)，CeA/PVN與脾臟之間有通路連接，而應激行為范式可以同時激活這兩個核團的CRH神經元。更重要的是，長期應激能夠激活脾神經從而增強免疫。該研究使我們認識到淋巴細胞介導的適應性免疫應答受到中樞-外周神經環(huán)路的直接調控，以及通過行為調節(jié)免疫應答的生物學基礎[10]。該研究提示了適度的應激有利于增強免疫，開辟了神經免疫學的新方向。

1.3 獎賞與藥物成癮

中腦邊緣多巴胺通路是腦內獎賞系統(tǒng)最重要的組成部分之一。過去幾十年的研究表明，該通路在獎賞搜索、強化學習、行為動機和執(zhí)行控制等方面起到關鍵作用。劉帥課題組采用光遺傳/化學遺傳等技術在獎賞與動機的神經機制領域開展了相關研究工作。在荷爾蒙和攝食肽對獎賞動機的調控機制方面，闡明了胰島素在獎賞中樞的腹側被蓋區(qū)的作用機制[11-12]；基于在胰島素中樞獎賞機制研究中的一系列發(fā)現(xiàn)，將胰島素對獎賞中樞兩個腦區(qū)在細胞和行為水平上作用的差異做了詳細的總結[13]；在皮質酮對獎賞搜索和焦慮樣行為的調控機制研究中，發(fā)現(xiàn)長期給予皮質酮會導致腹側被蓋區(qū)神經元興奮性和突觸傳遞的下降，其調控機制是胞體周圍多巴胺釋放量增加并由此激活D2受體產生自抑制。在腹側被蓋區(qū)給予D2受體拮抗劑，能恢復受損的獎賞搜索動機并減少焦慮樣行為。此外，該課題組在研究病理狀態(tài)下獎賞動機調控的神經環(huán)路機制時發(fā)現(xiàn)，與腹側被蓋區(qū)環(huán)路可將饑餓信息錯誤編碼為獎賞信息，這可能是神經性厭食癥的潛在的致病機制。解碼胰島素、皮質酮在中腦邊緣系統(tǒng)的精細調控作用，將在代謝疾病、藥物濫用和攝食疾病更有效的治療中起到至關重要的作用。

藥物成癮與人類健康密切相關，已引起社會的廣泛關注。藥物成癮形式多樣，如吸毒就是一種極具危害的藥物成癮，吸毒會引起認知損害與精神癥狀，且復吸率極高，目前尚缺乏有效干預。基于藥物成癮問題，袁逖飛課題組從藥物成癮伴隨的腦功能改變和創(chuàng)新神經調控與干預方面做了系列研究。在藥物成癮的神經機制研究中發(fā)現(xiàn)，藥物成癮會導致皮層可塑性的改變，皮層可塑性的下降可能與行為調試能力異常相關[14-15]，其中GluN3A是重要的調控分子；在神經調控與干預的研究中，通過神經調控干預體系可以降低藥物渴求度，削弱成癮藥物的“記憶”，如非侵入的經顱磁刺激干預降低海洛因與甲基苯丙胺成癮者渴求度[16-20]，改善睡眠、情緒[21]，降低沖動、風險行為等[22]。這些研究成果能為藥物和酒精成癮的干預提供實驗依據(jù)。

1.4 認知功能

衰老是生物體的必然生理過程，會伴隨著學習記憶及認知功能的衰退。Klotho基因家族由α、β和γ-Klotho組成，是內分泌成纖維細胞的共受體生長因子[23]。α-Klotho在大鼠和小鼠體內編碼1 014個氨基酸殘基組成的I型跨膜蛋白，在人體內編碼1 012個氨基酸殘基組成的I型跨膜蛋白[24]。研究表明，α-Klotho蛋白可以增強小鼠的認知功能并延緩衰老。Thomas Behnisch課題組發(fā)現(xiàn)，在多個腦區(qū)中，隨著年齡的增長，sKlotho的表達均有下降。在海馬的DG、CA1、CA3的sKlotho的表達也隨著年齡的增長而降低。這表明sKlotho可能和衰老合并的學習記憶下降有關。將人類sKlotho基因序列克隆到腺相關病毒血清型9載體，再定位注射到小鼠海馬區(qū)，檢測動物學習記憶及突觸功能和細胞存活相關蛋白表達的變化。結果顯示，Klotho過表達可以增強與突觸可塑性相關的信號通路，改善動物的筑巢行為，以及辨識記憶、空間記憶和恐懼記憶，并增強海馬CA1區(qū)突觸傳遞[25]。這表明Klotho在突觸可塑性相關的信號通路和衰老過程記憶行為中的調控作用。這一發(fā)現(xiàn)進一步闡明了衰老的機制，并為衰老相關疾病的研究提供了新靶點。

1.5 睡眠與覺醒

睡眠是生命所必需的過程，是機體復原、整合和鞏固記憶的重要環(huán)節(jié)，人的生命中約三分之一的時間都在睡眠中度過。但在現(xiàn)代社會，長期睡眠缺乏已經成為普遍現(xiàn)象。因此，深入理解睡眠與覺醒的機理變得越來越重要。王烈成教授介紹了課題組最新的研究工作：采用光遺傳和光電極來研究藍斑核-下丘腦腹外側視前區(qū)環(huán)路參與覺醒的調控。此外還詳細介紹了光遺傳技術在睡眠-覺醒研究領域中的應用和發(fā)展，包括光遺傳學操控局部核團，探索該核團在睡眠-覺醒調控中的作用[26-27]；光遺傳學操控特定神經環(huán)路研究該環(huán)路在睡眠-覺醒中的作用[28]；興奮性和抑制性光遺傳學結合在睡眠-覺醒調控研究中的應用[29]；光遺傳學結合在體電生理胞外記錄在睡眠-覺醒調控研究中的應用[30]。這些研究成果將為睡眠障礙的發(fā)生機理及防治提供指導。

2 神經生物學研究的新方法

為了推動神經生物學的發(fā)展，新的研究方法和創(chuàng)新技術應運而生。沙龍與會專家學者也針對神經生物學新的研究方法進行了深入探討。

2.1 溶酶體膜片鉗技術

倉春蕾課題組基于膜片鉗等技術，對溶酶體離子通道和神經退行性疾病的關聯(lián)做了相關研究。溶酶體是細胞中囊泡狀的細胞器，含多種水解酶，能降解不同來源的生物大分子和損傷的細胞器，被看作細胞內“回收站”，并且參與胞內信號轉導、自噬、凋亡和分泌等功能的調控。研究發(fā)現(xiàn)，衰老及相關神經退行性疾病常伴隨多種溶酶體結構和功能的異常[31]。溶酶體功能的正常發(fā)揮依賴于v-ATPase造成的酸性環(huán)境，溶酶體pH值異常會引起溶酶體儲存的鈣離子/鐵離子異常釋放，這種異常能導致蛋白聚集、細胞器功能異常和退行性疾病。因此，v-ATPase的突變與多種神經退行性疾病相關，在老年癡呆、帕金森綜合征、肌萎縮側索硬化等多種神經退行性疾病中均發(fā)現(xiàn)溶酶體pH值異常[32]。TPC(two pore channel)和mTOR形成ATP敏感的鈉離子通道，在細胞營養(yǎng)缺乏時，TPC能幫助維持溶酶體酸性環(huán)境，溶酶體pH值升高，TPC1激活，降低pH值，形成負反饋調控[33]。另外發(fā)現(xiàn)，溶酶體氯通道CLN7隨著溶酶體pH值降低而激活，進而上調pH值；溶酶體鉀通道Transmembrane protein 175(TMEM175)能調控鉀離子平衡、溶酶體膜電位、pH值和自噬流，研究表明，敲除TMEM175對帕金森綜合征模型有神經保護作用[34]。

2.2 體外神經網絡模型構建

大腦神經元長時程增強和長時程抑制是學習記憶的基礎，但并沒有在源自人類干細胞的神經元中得到證實，關于人類大腦神經網絡的研究，由于人腦組織難以獲取，所以在實驗研究上難以全面深入開展。為模擬真實人腦神經網絡研究模型，尋找神經回路，董毅課題組利用人類胚胎干細胞ChR2-EYFP分化出谷氨酸能神經元和γ-氨基丁酸神經元，構建出了具有學習記憶功能的人類體外神經網絡，并通過電生理、鈣離子成像和實時定量PCR等手段，證實該模型的可靠性，為今后人腦功能和神經類疾病的研究提供模型基礎，同時為類腦人工智能的發(fā)展提供創(chuàng)新性線索[35]。

3 神經生物學的應用轉化

隨著神經生物學的迅速發(fā)展，新的理論和研究成果不斷涌現(xiàn)，許多疾病的本質得以重新認識，疾病診斷的準確性得以提高，給疾病的治療帶來新的希望。

3.1 自閉癥

自閉癥是一種影響兒童發(fā)育的障礙類疾病。自閉癥患者擁有不同的感知方式，這種方式常使患者忽略社交或者沒有足夠能力去處理交際問題[36]。張晨課題組以Fmr1-/y小鼠作為自閉癥研究的動物模型，通過雙光子和鈣成像的方法驗證了不同強度的光刺激后，自閉癥小鼠與野生型小鼠反應的異常性，并發(fā)現(xiàn)負責接受處理視覺信號的初級視皮層V1區(qū)神經元微環(huán)路異常在自閉癥光刺激感覺異常中扮演重要的作用?；谶@一發(fā)現(xiàn)，課題組又驗證了“rescue-in-adult”方法可以糾正Fmr1-/y小鼠這種感覺異常。這一系列的研究揭示了自閉癥發(fā)生的相關機制，并為自閉癥的治療提供了新的思路[37]。

3.2 抑郁癥

抑郁癥現(xiàn)已成為中國疾病負擔第二的重大腦病，而傳統(tǒng)藥物如5-HT再攝取抑制劑起效緩慢，且僅對一部分患者的癥狀有持久改善作用。針對抑郁的新治療靶點的探索成為一個重大問題[38]，近年來研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮可以快速緩解抑郁癥狀[39]，但可能會產生嚴重的副作用，如成癮性。陳剛課題組從眾多抗抑郁藥物中篩選出有快速治療抑郁癥效果的越鞠丸[40]，并通過轉錄組學研究發(fā)現(xiàn)其抗抑郁作用可能與海馬中一種腦腸肽垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)增加有關。PACAP是一種與精神疾病如創(chuàng)傷后應激障礙(PTSD)、焦慮及抑郁癥相關的腦腸肽，越鞠丸能夠短時間內促進PACAP的表達和下游相關蛋白的表達[41]。運用光遺傳學技術激活海馬PACAP神經元，能夠產生較為持久的抗抑郁作用，而敲低或通過光遺傳抑制海馬PACAP能夠逆轉越鞠丸的抗抑郁作用，并引起抑郁樣行為。在臨床研究中也發(fā)現(xiàn)，抑郁患者血清中PACAP表達下降，這都證實了PACAP在快速抗抑郁中的作用。這是中藥復方反轉化的一個應用研究，由發(fā)現(xiàn)的中藥療效出發(fā)，結合光遺傳學技術，進而探索和驗證發(fā)揮該療效的機制，為中藥復方應用和開發(fā)研究提供新思路。

3.3 針灸基礎研究與轉化

現(xiàn)代針灸的研究基于中醫(yī)臨床，并與神經生物學關聯(lián)密切，在中醫(yī)針灸研究領域，應用神經生物學手段能夠揭示部分疾病的針灸治療相關的神經機制。榮培晶課題組在針灸經絡與腦相關調控效應研究方面，把針灸效應和腦科學技術研究結合起來，進一步探索針灸對腦的神經調控效應機制。在其研究工作中，重點闡釋在耳部經絡穴位和迷走神經相關的研究，提出“穴位-外周神經-腦網絡-機體功能整體調節(jié)”的新思路，例如：耳甲電針有效緩解抑郁癥狀研究，以及耳甲電針治療功能性消化不良的臨床研究等，并結合當前研究的前沿和熱點問題指出，未來針灸臨床和神經生物學有機結合需要更多技術革新和學科交叉，腦科學研究必將助力針灸發(fā)展[42-44]。無獨有偶，曾芳課題組基于神經影像技術的針刺神經調控研究將針灸與神經生物學進行了交叉融合。在基于神經影像技術的針刺治療功能性消化不良的中樞機制探討方面做了很多研究工作。在針刺效應中樞機制研究中，曾芳教授團隊主要研究的內容包括針刺穴位效應特異性、針刺效應影響因素和針刺治療機理等幾個方面，神經影像技術是該研究中可靠的技術手段，尤其在神經系統(tǒng)疾病和疼痛類疾病針刺治療機理的研究。近年來，曾芳教授以功能性消化不良為研究切入點，闡釋功能性消化不良相關腦區(qū)的改變，進而探討針刺治療功能性消化不良中樞調控機制[45-47]。運用神經影像技術對針刺治療疾病機制的研究，為今后針刺課題探討提供了新的思路。

周逸平研究員指出，傳統(tǒng)的就是世界的。目前，國際上已經有184個國家應用針灸，20多個國家對中醫(yī)藥針灸進行立法。我們應該加強中醫(yī)藥的研究。傳統(tǒng)意義上的生命科學都是研究軀體、內臟，這方面的研究僅有幾百年的歷史，而經脈臟腑的研究已經有兩千多年的歷史，從經脈臟腑理論到軀體內臟，是傳統(tǒng)中醫(yī)到現(xiàn)代醫(yī)學的一個重大邁進。因此，周逸平研究員認為：經脈臟腑是經絡理論的核心，而經脈臟腑與腦的聯(lián)系是中醫(yī)和現(xiàn)代神經生物學結合點和突破口，他呼吁生命科學領域廣大年輕的科研工作者應更多地關注中醫(yī)、針灸和經絡研究，運用現(xiàn)代生命科學的方法來探討臟腑與大腦神經系統(tǒng)的聯(lián)系以及臟腑之間的聯(lián)系。例如：目前對痛覺的研究多停留在體表痛，可以運用中醫(yī)臟腑理論中臟腑之間的聯(lián)系來探索內臟痛的改善方法，這對緩解癌癥患者的內臟痛有重要意義。周逸平研究員強調要進一步利用中醫(yī)的優(yōu)勢，將現(xiàn)代生物學與中醫(yī)相聯(lián)系，這是中醫(yī)現(xiàn)代應用的新前景，也是未來神經生物學發(fā)展的大勢所趨。

4 展望

光遺傳學技術使神經科學研究中復雜抽象的生物學機制能夠變得更加直觀。因此，光遺傳學技術也被譽為21世紀神經生物學最有影響力的技術方法之一。光遺傳學在神經生物學領域的應用，以及在今后科研工作中的學科交叉融合將是大勢所趨，將現(xiàn)代科學技術應用在神經科學和各個領域的發(fā)展中，對現(xiàn)代生命科學的騰飛有重大意義。