吳 帆,張 莉,周 晶,常 悅,郎一涵,沈葉萍,王 靚,李紅亮

(中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計量及檢疫檢驗重點實驗室,浙江 杭州 310018)

在自然界中,有80%以上的開花植物需要傳粉者為它們授粉,其中大部分的傳粉者是昆蟲[1]。作為重要的傳粉昆蟲之一,蜜蜂基于其獨特的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性,在植物傳粉方面很有優(yōu)勢。它不僅在維持植物生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性和促進(jìn)生物多樣性方面發(fā)揮著重要的作用,而且能提高農(nóng)作物和果蔬的產(chǎn)量和品質(zhì),具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益[2,3]。

我國飼養(yǎng)的蜜蜂達(dá)900萬群,主要有東方蜜蜂中的亞種中華蜜蜂(中蜂,Apisceranacerana)和西方蜜蜂的亞種意大利蜜蜂(意蜂,Apismelliferaligustica),其中中蜂約占三分之一,意蜂約占三分之二。中蜂是我國的本土蜜蜂,相對于意蜂,中蜂在長期進(jìn)化過程中形成了適應(yīng)山區(qū)環(huán)境的特性,在利用零星蜜源、采集能力和利用率上都有顯著的優(yōu)勢[4-5]。另外,由于我國部分地區(qū)中蜂采用野生和半野生的養(yǎng)殖方式,其抗寒抗病等能力也較強(qiáng),這不僅延長了傳粉時間,也有利于山區(qū)丘陵等高寒環(huán)境下的植物授粉[5-6]。因此,調(diào)查中蜂傳粉植物種類以及規(guī)律,有利于人們認(rèn)知中蜂在植物生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用,為后期中蜂的利用和保護(hù)提供理論依據(jù)[7]。

近些年,隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)的推廣和應(yīng)用,利用昆蟲授粉將有廣泛的空間。設(shè)施農(nóng)業(yè)在增強(qiáng)農(nóng)業(yè)綜合生產(chǎn)能力、提高市場競爭力和抵抗風(fēng)險能力方面具有顯著優(yōu)勢[8]。但是,設(shè)施農(nóng)業(yè)種植需要相對封閉的環(huán)境,栽培空間內(nèi)野生傳粉昆蟲的數(shù)量極少,這就導(dǎo)致果蔬的坐果率嚴(yán)重不足[9]。因此,種植者依靠外界的輔助手段來增加授粉效率,如人工蘸花和人工噴施生長調(diào)節(jié)劑等來增加坐果率[10]。然而,人工授粉方式費時費力,噴施生長調(diào)節(jié)劑又會導(dǎo)致果實化學(xué)藥劑污染。所以,利用昆蟲授粉成為理想的選擇,且中蜂在設(shè)施農(nóng)業(yè)授粉中已有應(yīng)用[11]。但是,目前對中蜂傳粉特性及季節(jié)差異性還不十分清楚,如果對中蜂傳粉行為和規(guī)律深入調(diào)查研究,將有利于未來在設(shè)施農(nóng)業(yè)中應(yīng)用。綜上所述,本研究通過深入了解蜜蜂對不同植物的傳粉習(xí)性和規(guī)律,既有利于維持植物生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和保護(hù)生物多樣性,也有利于幫助農(nóng)業(yè)種植者提高農(nóng)作物的產(chǎn)量品質(zhì)及經(jīng)濟(jì)效益,為選擇蜜蜂進(jìn)行作物授粉提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

中華蜜蜂飼養(yǎng)于中國計量大學(xué)校園內(nèi)(北緯30.32°,東經(jīng)120.36°,圖1),所有蜂王從育成至實驗開始時均不滿1年,具有強(qiáng)勁的產(chǎn)卵能力。實驗中共用3箱中蜂,使用的蜂箱是標(biāo)準(zhǔn)的木質(zhì)朗氏活框蜂箱。實驗實施時間為2019年3-5月。

圖1 樣品采集范圍(圖示中1的位置,即中國計量大學(xué)校園)Figure 1 Sample collection area(labeled as “1”, that is the campus of China Jiliang University)

1.1 采集地植物花粉信息庫的建立

采集開花植物花粉及建立蜜蜂花粉源信息庫。實驗期間在中國計量大學(xué)及周邊(圖1)觀察、記錄植物的開花情況,采集一定量開花植物的花蕊并收集其花粉。將花粉存放于-20 ℃下保存,利用尼康YS100光學(xué)顯微鏡(Nikon,Japan)和日立TM-1000電子顯微鏡(HITACHI,Japan)觀察,并通過查找《中國木本植物花粉電鏡掃描圖志》和利用伯樂MyCycler PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad,USA)擴(kuò)增等技術(shù)初步建立樣地植物花粉信息庫。

1.2 蜂花粉樣本采集及光學(xué)顯微鏡觀察

在適合時間(天氣晴朗、溫濕度適中的環(huán)境條件下),每周3～4次的采集頻率,每次早、中、晚各采集一次,捕捉一定量后足攜帶花粉的采集蜂。將蜂花粉樣本在光學(xué)顯微鏡下觀察,初步鑒定蜂花粉的形態(tài)并估算不同種類的花粉在蜂花粉中的占比,做好實驗記錄。其余蜂花粉樣本置于-20 ℃儲存,以備后期電鏡觀察鑒別使用。

1.3 蜂花粉樣本掃描電子顯微鏡觀察

在日立TM-1000掃描電子顯微鏡(HITACHI,Japan)下逐粒觀察前期收集的蜂花粉,記錄形態(tài)并與信息庫做比較,確定每粒蜂花粉中所含花粉的植物源種類。

1.4 蜂花粉樣本DNA條形碼分析

對于電鏡觀察后無法辨別種類的蜂花粉,我們利用DNA擴(kuò)增和條形碼深入分析。使用生工生物工程股份有限公司(Sangon,China)的Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒,從100 mg蜂花粉樣品中提取未知植物源的DNA(提取方法見說明書)。設(shè)計合適的引物序列,以上述花粉DNA為模板用MyCycler PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad,USA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)采用3步法擴(kuò)增程序:變性、退火和延伸,各自溫度和時間為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃,20 s;X ℃(根據(jù)引物設(shè)定),20 s;72 ℃,40 s;做35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增后的序列進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,回收PCR產(chǎn)物送至生工進(jìn)行測序,最后利用生物信息學(xué)分析,確定蜂花粉的種類。

2 結(jié)果與討論

2.1 采集地植物花粉信息庫的建立

實驗期間在中國計量大學(xué)及周邊地區(qū)收集開花植物花粉共37種,在采集花粉的同時拍攝植物照片,后期通過查找和比對《中國高等植物圖鑒》進(jìn)行鑒定,無法確定的植物再利用電子顯微鏡觀察及查詢《中國木本植物花粉電鏡掃描圖志》以及DNA條形碼等技術(shù)分析,初步建立樣地植物花粉信息庫。結(jié)果表明,3—5月學(xué)校及周邊開花植物包括:紫葉李[PrunusCerasiferaEhrharf.],迎春花[JasminumnudiflorumLindl.],浙江尖葉山茶[Camelliacuspidate],山櫻花[Cerasusserrulate(Lindl.) G.Don ex London],垂絲海棠[MalushallianaKoehne],浙江紅山茶[CamelliaChekiangoleosaHu],多花薔薇[RosamultifloraThunb.],重瓣榆葉梅[Amygdalustrilobaf.multiplex(Bge.) Rehd.],紫荊[CercischinensisBunge],石榴[PunicagranatumLinn],玉蘭[MagnoliadenudateDesr.],尖萼金絲桃[HypericumacmosepalumN.Robson],瓜葉菊[Pericallishybrida],暴馬丁香[Syringareticulata(Blume) H.Hara var.amurensis(Rupr.) J.S.Pringle],石楠[Photiniaserratifolia(Desfontaines) Kalkman],鵝掌楸[Liriodendronchinense(Hemsl.) Sargent.],貼梗海棠[Chaenomelesspeciosa(Sweet) Nakai C.Lagenaria Koidz],月季[RosachinensisJacq.],荷花玉蘭[MagnoliagrandifloraLinn],長葉木蘭[MagnoliapaenetalaumaDandy],金橘[Fortunellamargarita(Lour.) Swingle],三色堇[ViolatricolorL.],杏花[Armeniacavulgaris],結(jié)香[Edgeworthiachrysantha],金盞花[CalendulaofficinalisL.],木繡球[ViburnummacrocephalumFort.],瓊花[ViburnummacrocephalumFort.f.keteleeri(Carr.) Rehd.],杜鵑[RhododendronsimsiiPlanch.],火棘[Pyracanthafortuneana(Maxim.) Li],香泡[Citrusmedica],香樟[Cinnamomumcamphora(L.) Presl.],七姊妹[RosamultifloraThunb.var.carneaThory],棕櫚[Trachycarpusfortune(Hook. f.) H.Wendl.],女貞[Ligustrumlucidum],向日葵[HelianthusannuusL.],碧冬茄[Petuniahybrida],金雞菊[Coreopsisdrummondii]。

其中大部分為多年生開花植物,如紫葉李、玉蘭、鵝掌楸等喬木和灌木;少部分為學(xué)校移栽的一年至兩年生的觀賞性植物,如三色堇、碧冬茄、金盞花等草本植物。

2.2 蜂花粉收集及顯微鏡觀察

在蜂箱巢門口等待,抓取足部帶花粉的采集蜂,收集花粉。期間共收集23次,平均每次約12粒,共約300?；ǚ?。觀察結(jié)果顯示,每天收集的蜂花粉約有3～4種花粉植物源(不同日期有重復(fù)收集現(xiàn)象),利用光學(xué)顯微鏡(40×)下觀察,初步辨別出不同形態(tài)的花粉(圖2),共收集了27種蜂花粉。

圖2 光學(xué)顯微鏡下部分蜂花粉Figure 2 Pictures of bee pollens under an optical microscope

對普通光學(xué)顯微鏡無法確定植物源的蜂花粉,進(jìn)一步利用電子顯微鏡觀察,將拍攝的蜂花粉電鏡照片與《中國木本植物花粉電鏡掃描圖志》及樣地植物花粉電鏡圖進(jìn)行對比,根據(jù)花粉形狀、大小以及花粉壁的結(jié)構(gòu)和紋飾,最終鑒定出21種植物花粉(圖3)。

蜂花粉的植物源依次為:1—紫葉李;2—迎春花;3—浙江尖葉山茶;4—山櫻花;5—垂絲海棠;6—浙江紅山茶;7—多花薔薇;8—重瓣榆葉梅;9—紫荊;10—石榴;11—玉蘭;12—尖萼金絲桃;13—瓜葉菊;14—暴馬丁香;15—石楠;16—鵝掌楸;17—貼梗海棠;18—月季;19—荷花玉蘭;20—長葉木蘭;21—金橘

2.3 DNA條形碼技術(shù)鑒定蜂花粉

經(jīng)過電子顯微鏡觀察分析后,還有6種蜂花粉未能明確辨別出其花粉源植物的種類,最后通過DNA條形碼進(jìn)行鑒定。使用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒,對這些蜂花粉進(jìn)行DNA提取,結(jié)果表明可以成功提取蜂花粉DNA,NanoDrop 2000測定提取DNA質(zhì)量濃度均超過200 ng/μL。PCR擴(kuò)增使用的引物是由生工公司合成,引物序列如表1。

表1 用于DNA條形碼分析的引物序列

本實驗選擇兩組引物用于DNA條形碼分析,第一組使用TPtrnH-F、TPpsbA-R分別作為正反引物,第二組使用rbcL-1F、rbcL-724R作為正反引物,以上述蜂花粉提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對擴(kuò)增后的樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)果照片如圖4。

圖4 DNA條形碼基因擴(kuò)增電泳圖Figure 4 Gene amplification result of DNA barcode analysis

根據(jù)電泳結(jié)果可知,使用rbcL-1F、rbcL-724R作為正反引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的效果較好。瓊脂糖凝膠塊,用生工SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收目的條帶,送至公司測序。但是,由于送檢樣品DNA濃度過低,未能測出目的條帶序列。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)上述蜂花粉植物源鑒定結(jié)果,繪制了蜂花粉植物源分布情況。如圖5所示,2019年3月上旬,由于溫度過低(只有5～12 ℃),學(xué)校校園內(nèi)及周圍沒有發(fā)現(xiàn)中蜂采集花粉的行為。箱內(nèi)檢查發(fā)現(xiàn)還有少量蜂糧,說明蜂群正常越冬。3月中下旬,開始觀察到中蜂采粉回巢的現(xiàn)象。該時間段內(nèi)中蜂采集周期最長的為迎春花和浙江尖葉山茶的花粉,整個3月下旬都有采集。除此之外,中蜂對紫葉李、山櫻花、浙江紅山茶花粉的采集時間也較長,都有一周左右得時間。在3月份,也觀察到中蜂采集蠶絲海棠、多花薔薇、重瓣榆葉梅和紫荊的花粉,但周期很短,只在月底觀察到一次。

圖5 3-5月份中蜂采集蜂花粉植物源分布情況圖Figure 5 Plant source distribution map of bee pollen collected by Apis cerana cerana from March to May

4月份,中蜂繼續(xù)采集浙江紅山茶、浙江尖葉山茶、山櫻花和紫荊花粉,其中浙江紅山茶整個4月中蜂都有采集,是實驗期間內(nèi)采集周期最長的植物源,約有40 d。相對于3月份,4月份中蜂采集的新花粉源有鵝掌楸、貼梗海棠、月季、荷花玉蘭、長葉木蘭和金桔,而且都集中在4月下旬,其中鵝掌楸和月季的采集周期較長。此外,中蜂在4月份的采集行為要比3月份更為活躍,這可能與蜂王產(chǎn)卵能力增強(qiáng)有關(guān)。因為幼蟲發(fā)育需要工蜂飼喂蜂王漿,而蜂王漿蛋白的合成來源主要來自于花粉中的蛋白質(zhì)[12]。研究表明,幼蟲哺育能力強(qiáng)的蜂群其花粉采集能力也更好[13]。

相對于3、4月份,5月份中蜂的采集活動明顯減少,甚至下旬沒有觀察到采集活動。調(diào)查發(fā)現(xiàn),一方面由于學(xué)校及周邊開花植物源減少,另一方面推測可能由于采集花朵花期較短、花朵閉合蜜蜂難以采集。但是,中蜂采集到了尖萼金絲桃、瓜葉菊、暴馬丁香和石楠等幾種新植物源的花粉,其中采集尖萼金絲桃是在5月初,采集瓜葉菊、暴馬丁香和石楠是在5月中上旬。

統(tǒng)計蜜蜂所攜花粉植物源所屬生物學(xué)分類科別(見圖6)可知,采集數(shù)量排在前五的科分別是木蘭科(29%)、薔薇科(27%)、山茶科(10%)、豆科(8%)和木犀科(7%)。中蜂采集的花粉中屬于木蘭科的植物有鵝掌楸、荷花玉蘭、長葉木蘭、玉蘭;屬于薔薇科的植物有紫葉李、山櫻花、垂絲海棠、多花薔薇、榆葉梅、貼梗海棠、月季、石楠;屬于山茶科的植物有浙江尖葉山茶、浙江紅山茶;屬于豆科的植物有紫荊;屬于木犀科的植物有迎春花、暴馬丁香。

圖6 中蜂3-5月采集的蜂花粉植物源科分布圖Figure 6 Family distribution map of bee pollen collected by Apis cerana cerana from March to May

總體而言,中蜂可為多種開花植物傳粉,這對維持植物生存和生態(tài)穩(wěn)定具有重要意義。結(jié)合校園內(nèi)及周邊開花植物源情況進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn):第一,中蜂采集不同花粉的周期與植物源的開花時間具有高度一致性;第二,中蜂對一年至兩年生的觀賞性植物采集很少,可能是遷移栽種時間短,中蜂還未適應(yīng),故不喜采集。因此,我們認(rèn)為,在長期的生態(tài)衍化進(jìn)程中,中蜂已經(jīng)對棲息地植物形成了良好的適應(yīng)性,可根據(jù)花期動態(tài)演化而調(diào)整采集行為;不過對于同花期的植物源來說,中蜂采集行為仍然具有偏好性,這與植物源的花型、花期和蜜粉含量等有密切關(guān)系。

通過蜜蜂攜帶花粉可以初步判定傳粉植物的種類及傳粉多樣性,然而這種判斷具有一定的局限性。比如某些開花植物蜜多粉少,而采粉蜂不去采集這種蜜粉源,但采蜜蜂在采集此種蜜粉源植物時即使后足不攜帶花粉團(tuán),實際上也產(chǎn)生了傳粉行為。因此本研究只適用于對蜜蜂粉源充足的植物。實際上本研究涉及的37種植物確實均為多粉源植物,即如果采集蜂對該植物有采集行為,就能實現(xiàn)攜粉歸巢。實驗中未見多蜜而少粉的植物,故不考慮蜜蜂采蜜時的間接授粉的情況。

3 結(jié) 論

綜上所述,浙江省杭州市錢塘新區(qū)中國計量大學(xué)校園內(nèi)及周邊地區(qū)3-5月份開花植物約有37種,其中中華蜜蜂可以傳粉的植物達(dá)到27種,占總數(shù)的73%,說明中蜂的傳粉植物種類具有廣譜性。在長期共進(jìn)化過程中,中蜂的傳粉行為已經(jīng)適應(yīng)了相應(yīng)開花植物的花期,這種適應(yīng)性對于中蜂和植物雙方維系都有益處,也是地理生態(tài)長期共同進(jìn)化的結(jié)果。不過,對于同花期的開花植物源,中蜂傳粉仍具有一定的選擇性和偏好性,如偏好為花朵形態(tài)較大且易采集的薔薇科、木蘭科等植物,而對形態(tài)較小且閉合的花朵采集能力相對較低。本研究有助于我們進(jìn)一步了解中蜂傳粉習(xí)性和規(guī)律,也給中蜂養(yǎng)殖和農(nóng)作物種植有機(jī)結(jié)合提供了科學(xué)基礎(chǔ)。此外,在設(shè)施農(nóng)業(yè)種植中合理引入中蜂授粉以及不同植物間套種植,可以提高授粉效率進(jìn)而提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)。