余 庭,蔣 晗,楊宇婷,林如夢,吳江春,李奕嫻,朱 誠

(中國計量大學 生命科學學院 浙江省海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術重點實驗室,浙江 杭州 310018)

美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)是一種嗜鹽的革蘭氏陰性菌,呈桿狀或者球狀,它分為美人魚亞種(P.damselaesubsp.damselae)和殺魚亞種(P.damselaesubsp.piscicida),兩者的重要區(qū)別是美人魚亞種含有特異基因ureC。美人魚發(fā)光桿菌分布范圍廣,致病性強,是養(yǎng)殖魚類的重要致病菌[1-2]。此外,它還可以通過食物鏈或傷口感染等途徑感染人類或哺乳動物,引起敗血癥,對公眾健康造成重大危害[3-4]。近年來,國內(nèi)外養(yǎng)殖魚類感染美人魚發(fā)光桿菌的病例逐漸增大,給魚類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失[5-6]。因此,建立一種快速、準確、有效的檢測美人魚發(fā)光桿菌的方法,對海水養(yǎng)殖業(yè)和食品安全管理具有重要意義。

目前,對美人魚發(fā)光桿菌的檢測,主要是采用傳統(tǒng)的細菌分離鑒定、生理生化鑒定和基于PCR技術的分子檢測[4,6-7]等方法。然而這些方法耗時長、操作復雜,且需要專業(yè)的儀器設備和技術人員。重組酶聚合酶擴增技術(recombinase polymerase amplification,RPA)是一種高效的恒溫核酸擴增技術,可在常溫條件下實現(xiàn)核酸指數(shù)擴增,具有反應靈敏、高效、性價比高的特點,一般在30 min以內(nèi)即能獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物[7-10]。通過與熒光基團標記,RPA擴增產(chǎn)物可與側(cè)流層析試紙條(lateral flow dipstick,LFD)相結合,實現(xiàn)擴增產(chǎn)物的可視化檢測。RPA技術自2006年發(fā)明以來發(fā)展迅速,在動物疫病診斷、微生物及其耐藥性檢測等領域均得到了很好的應用。如RPA技術已成功應用到日本血吸蟲、豬嵴病毒、布魯氏菌和磺胺耐藥基因等的檢測中,并結合LFD,其檢測結果在2～5 min內(nèi)直接可視[11-14]。雖然RPA-LFD技術存在易因氣溶膠污染導致假陽性等弱點,但其檢測時間短、靈敏度高、無需儀器且常溫下即可反應等優(yōu)勢,其在基層檢測領域有較好的應用前景。

本項目以美人魚發(fā)光桿菌特異基因bamB和美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種特異基因ureC為檢測靶標基因[15],采用RPA技術進行核酸擴增,并結合側(cè)流層析技術,建立一種快速、準確、有效的美人魚發(fā)光桿菌及其亞種的可視化檢測方法,這對美人魚發(fā)光桿菌的快速檢測、早期預警、保障水產(chǎn)養(yǎng)殖安全和公眾健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

金黃色葡萄球菌GIM 1.644、大腸桿菌GIM 1.173、腸炎沙門氏菌腸炎亞種GIM 1.345、副溶血性弧菌GIM 1.306、霍亂弧菌GIM 1.449、鮑曼不動桿菌GIM 1.650、綠膿桿菌GIM 1.220、嗜水氣單胞菌GIM 1.551、美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種GIM 1.1032均購買于廣東省微生物菌種保藏中心。其余美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種和殺魚亞種為本實驗室前期分離保藏菌種。營養(yǎng)瓊脂、LB肉湯、血平板、3%NaCl堿性蛋白胨水均購買于青島海博生物技術有限公司,細菌基因組提取試劑盒和Premix Ex Taq(Probe qPCR)試劑盒購買于TaKaRa公司,RPA相關試劑盒TwistAmp Basic Kit,LFD紙質(zhì)條及金標抗體和緩沖液等側(cè)流層析相關試劑購自英國TwistDx公司。

1.2 細菌培養(yǎng)及基因組DNA提取

各菌株按照菌株使用說明書進行復蘇增菌,挑取單菌落至液體培養(yǎng)基中增菌,按照細菌基因組試劑盒使用說明提取細菌基因組,保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 濃度梯度樣品稀釋

取OD600為1.0的美人魚發(fā)光桿菌及其亞種培養(yǎng)液1 mL,按照10倍梯度進行稀釋并進行平板活菌計數(shù),每組濃度3個平行,取平均值計算原液中的細菌數(shù)量。將經(jīng)活菌計數(shù)的美人魚發(fā)光桿菌及其亞種培養(yǎng)液進行10倍稀釋,109～100CFU/mL的濃度梯度的菌液,分別用試劑盒方法提取DNA,獲得濃度梯度標準品。

1.4 引物設計與RPA-LFD檢測原理

根據(jù)NCBI中美人魚發(fā)光桿菌的bamB(NZ_CP035780.1)序列及美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種特異基因ureC(NZ_CP035782.1)序列,利用Primer Premier 5.0軟件設計RPA引物,利用Beacon Designer 7設計熒光定量PCR引物和Taqman探針。引物和探針序列見表1,由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 RPA擴增和熒光定量PCR擴增引物與探針序列

RPA-LFD檢測原理如圖1。bamB基因上游引物bamB-LF標記Digoxin,下游引物標記FAM;ureC基因上游引物ureC-F標記Digoxin,下游引物標記Biotin。側(cè)流層析試紙條C線標記有二抗,T1線標記有抗FAM抗體,T2線標記有抗Biotin抗體。bamB基因和ureC基因RPA擴增產(chǎn)物在試紙條層析時與標記的相應抗體結合,同時抗Digoxin金標抗體可與C線標記的二抗和帶Digoxin標記的RPA擴增產(chǎn)物結合,從而實現(xiàn)試紙條的C線、T1線和T2線顯示。

圖1 RPA-LFD檢測原理圖Figure 1 Diagram of RPA-LFD detection principle

1.5 RPA-LFD的反應條件及優(yōu)化

根據(jù)TwistAmp Basic Kit試劑盒使用說明,配制50 μL RPA反應體系:25 μL 2×RE reaction buffer、11.5 μL ddH2O、各2 μL引物(10 μmol/L)、2 μL酶工作液、1 μL DNA模板和2.5 μL的醋酸鈉溶液(280 mmol/L)。在37 ℃反應20 min。取2 μL的反應產(chǎn)物加入到98 μL的PBST(0.05%吐溫20)緩沖溶液中,將試紙條插入緩沖液中室溫放置5 min后觀察結果。為提高兩個目標基因的擴增效率,對RPA-LFD試驗的引物濃度、反應溫度和反應時間進行了優(yōu)化。根據(jù)試劑盒建議的RPA反應最優(yōu)引物濃度范圍,共設置了8組引物濃度比例優(yōu)化獲得最優(yōu)引物濃度,bamB基因引物和ureC基因引物濃度(nmol/L)比依次為:200∶200;300∶200;300∶300;400∶300;400∶400;500∶400;500∶500和600∶600。在引物濃度優(yōu)化的基礎上對反應溫度(35 ℃,37 ℃,39 ℃,41 ℃,43 ℃,45 ℃,47 ℃)、反應時間(5,10,15,20,25,30 min)進行優(yōu)化。見圖2。

注:(a)1—0∶0;2—200∶200;3—300∶200;4—300∶300;5—400∶300;6—400∶400;7—500∶500;8—600∶600;(b)1—35 ℃;2—37 ℃;3—39 ℃;4—41 ℃;5—43 ℃;6—45 ℃;7—47 ℃;8—陰性對照;(c)1—30 min;2—25 min;3—20 min;4—15 min;5—10 min;6—5 min;7—陰性對照

1.6 特異性試驗

以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌腸炎亞種、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、鮑曼不動桿菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌、美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種共10種菌種基因組DNA分別作為RPA模板,無菌水作為陰性對照,采用前期已優(yōu)化的反應體系進行RPA-LFD試驗,以評估其特異性。

1.7 靈敏度試驗

分別將1.3節(jié)制備的濃度梯度標準品作為模板,采用優(yōu)化后的RPA-LFD反應條件,進行美人魚發(fā)光桿菌RPA-LFD方法的靈敏度試驗。同時,與常規(guī)熒光定量PCR方法靈敏度進行比較分析。qPCR反應體系為25 μL∶12.5 μL 2×Premix Ex Taq(Probe qPCR) buffer,0.5 μL Forward Primer,0.5 μL Reverse Primer,1 μL Taqman Probe,1 μL 模板和9.5 μL無菌水。反應程序為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。

1.8 實際樣品試驗

選取黃魚養(yǎng)殖基地的50份病魚樣本和美人魚發(fā)光桿菌陽性樣品6份(美人魚亞種5份,殺魚亞種1份)。參考食品衛(wèi)生微生物學檢測國家標準進行樣品處理,將樣本均質(zhì)液接種于營養(yǎng)瓊脂上,30 ℃培養(yǎng)12 h,挑取單菌落接種于血平板上,30 ℃培養(yǎng)12 h,挑取有溶血環(huán)菌落于3% NaCl堿性蛋白胨水中進行增菌。取2 mL菌液離心后提取基因組。對比生化特性分析和常規(guī)熒光定量PCR方法,用建立的美人魚發(fā)光桿菌RPA-LFD方法進行菌株鑒定,以結果的一致性評估該方法在實際樣品的實用性[1,4,7]。

2 結果與分析

2.1 RPA-LFD反應條件優(yōu)化

引物濃度優(yōu)化、反應溫度和反應時間優(yōu)化結果如圖2:不同引物濃度條件下進行RPA-LFD試驗,在試紙條檢測線上均可出現(xiàn)目標檢測條帶。其中,bamB基因引物濃度與ureC基因引物濃度均為400 nmol/L時,目標檢測線較為清晰。在反應溫度優(yōu)化試驗中,37～43 ℃的反應溫度條件下,目標檢測線較為清晰,綜合考慮檢測應用,選取37 ℃為最優(yōu)反應溫度。在反應時間優(yōu)化試驗中,反應5 min即可看到檢測線,在15 min后檢測線亮度無明顯差別,選取15 min為最優(yōu)反應時間。

2.2 特異性試驗

對2種美人魚發(fā)光桿菌和其他8種水產(chǎn)中常見病原菌進行特異性檢測及美人魚發(fā)光桿菌亞種分類檢測試驗中,美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種顯示出2條檢測線,殺魚亞種顯示1條檢測線,其他菌株未出現(xiàn)檢測線,顯示陰性,檢出結果與常規(guī)熒光定量PCR結果一致(圖3)。結果表明本研究建立的美人魚發(fā)光桿菌RPA-LFD檢測方法特異性良好,且能鑒定到美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種。

注:M-TaKaRa DL 1000 marker;1—美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種;2—美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種;3—金黃色葡萄球菌;4—大腸桿菌;5—腸炎沙門氏菌腸炎亞種;6—副溶血性弧菌;7—霍亂弧菌;8—鮑曼不動桿菌;9—綠膿桿菌;10—嗜水氣單胞菌;11—陰性對照

2.3 靈敏度試驗

在最佳的RPA-LFD反應體系下,以109CFU/mL、108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL和100CFU/mL系列稀釋度菌液的基因組DNA為反應模板進行RPA-LFD靈敏度試驗。結果顯示,本研究建立的美人魚發(fā)光桿菌低濃度為101CFU/mL,如圖4(a),4(b),與常規(guī)熒光定量PCR方法結果一致,如圖4(c)。

注:M—DL2000 marker;1—109 CFU/mL;2—108 CFU/mL;3—107 CFU/mL;4—106 CFU/mL;5—105 CFU/mL;6—104 CFU/mL;7—103 CFU/mL;8—102 CFU/mL;9—101 CFU/mL;10—100 CFU/mL;11—陰性對照

2.4 實際樣品檢測

在本次留樣樣品的復檢中,本研究建立的美人魚發(fā)光桿菌RPA-LFD方法檢出結果與生化特性分析和熒光定量PCR方法結果一致,均檢出美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種陽性5份,美人魚亞種1份,無假陰性情況(表2)。該方法與生化特性分析和熒光定量PCR方法相比,檢測時間明顯縮短,檢測便捷性明顯提高。生化特性分析方法需要過夜培養(yǎng),熒光定量PCR方法需要擴增1.5 h以上,且均依賴于生化鑒定系統(tǒng)和熒光定量PCR儀等大型儀器。然而本文的檢測方法可在15 min完成擴增、30 min內(nèi)完成檢測,且檢測結果可直接通過試紙條判定,從而大大提高了檢測效率,且適合基層推廣。

表2 不同方法在實際樣品檢測中的應用

3 討 論

本研究以RPA技術為基礎,建立了美人魚發(fā)光桿菌可視化的雙重RPA-LFD檢測方法。本方法以美人魚發(fā)光桿菌特異基因bamB和美人魚亞種特異基因ureC為靶標序列,當bamB、ureC引物濃度均為400 nmol/L,反應溫度為37 ℃,反應時間為15 min時,該方法的擴增效率最高,且特異性好,檢測靈敏度高。在實際樣品檢測應用中,該方法與細菌培養(yǎng)法和熒光定量PCR法檢出結果一致,檢測準確高。本研究將RPA-LFD方法應用到美人魚發(fā)光桿菌的檢測,實現(xiàn)了雙檢測靶標的可視化同步檢測。本方法較傳統(tǒng)生化特性分析和常規(guī)熒光定量PCR方法,大大縮短了檢測時長,降低了對昂貴儀器設備及專業(yè)技術人員的依賴性,能很好滿足基層檢測。目前,水產(chǎn)高密度集約化養(yǎng)殖模式引發(fā)的水產(chǎn)疾病時有發(fā)生,而加強對水體環(huán)境和相關水產(chǎn)中致病菌的檢測,對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人類健康具有重要意義。本文研究建立的美人魚發(fā)光桿菌可視化RPA-LFD檢測方法,可為水產(chǎn)品中其他致病菌微生物的快速檢測研究提供借鑒。