孟祥凱, 王小龍, 薛 鑫

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210046)

Caspase-1屬于Caspase家族，也被稱為IL-1β轉(zhuǎn)換酶(ICE)，水解切割某些蛋白質(zhì)，如炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的前體，從而加工pro-IL-1β和pro-IL-18等炎癥因子使其成熟并釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，因此，Caspase-1在炎癥反應(yīng)中起著核心調(diào)控作用[1-4]。此外，Caspase-1還能將甲狀腺激素誘導(dǎo)劑Gasdermin D切割成活性形式，介導(dǎo)一種特殊的促炎癥的程序性細(xì)胞凋亡[5-7]。

Chart 1

目前報(bào)道的Caspase-1的合成抑制劑分為兩類：一類是針對(duì)Caspase-1的生理底物而設(shè)計(jì)的肽類(Tyr-Val-Ala-Asp)抑制劑，往往在Caspase-1特異識(shí)別的天冬氨酸(Asp)處連接一個(gè)親電的基團(tuán)，如醛基、苯甲酮、鹵甲基酮[8-9]。另一類是非肽類小分子有機(jī)化合物，由于非肽類小分子抑制劑具有免疫反應(yīng)小、分子量低、易于穿透血腦屏障，具有較好的藥代動(dòng)力學(xué)的性質(zhì)，受到廣泛的關(guān)注和開發(fā)[10-11]。

Scheme 1

圖1NCGC00183434與Caspase 1結(jié)合的分子對(duì)接模型：(a)帶狀；(b)填充

肽類Caspase-1抑制劑NCGC00183434具有活性高、易于合成等優(yōu)點(diǎn)，一直作為Caspase-1靶點(diǎn)研究的陽(yáng)性對(duì)照藥，但在臨床研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)機(jī)體有一定的毒性，因此未能成藥[13]。通過(guò)研究NCGC00183434的作用方式發(fā)現(xiàn)[12](圖1)， S1部分處于溶劑區(qū)，與蛋白沒有直接相互作用，而其他部位均有對(duì)應(yīng)口袋，可與半胱氨酸殘基285、精氨酸殘基341和179等殘基形成相應(yīng)的氫鍵，因此，用骨架躍遷的方法對(duì)S1部位改造，用吡啶環(huán)替換了原來(lái)的吡咯環(huán)，沒有改變分子原來(lái)的走向，從而設(shè)計(jì)出全新結(jié)構(gòu)的非肽類小分子Caspase-1抑制劑(Chart 1)。

陽(yáng)性藥NCGC00183434的合成主要是4個(gè)氨基酸的脫保護(hù)縮合過(guò)程(Scheme 1)，且氨基酸自帶手性，合成過(guò)程不需要考慮手性問(wèn)題，合成比較簡(jiǎn)單。目標(biāo)化合物為非肽小分子，從整體來(lái)看，可分為3部分，其中中間部分含有一個(gè)手性中心，可引入一個(gè)帶有手性且空間位阻較大基團(tuán)，通過(guò)手性誘導(dǎo)的方法保持構(gòu)型，或者可以通過(guò)手性拆分得到所需構(gòu)型化合物。另外，吡啶5-位溴活性可能較差，直接引入氨基將其取代可能難度較大，嘗試先用碘取代吡啶5-位溴，然后再由氨基進(jìn)行取代(Scheme 2)。

Scheme 2

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

WRS-1B型數(shù)字熔點(diǎn)儀；Bruker AV 400 MHz/500 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6或CDCl3為溶劑, TMS為內(nèi)標(biāo))；Thermo ScientificTMQ ExactiveTMFocus型四極桿軌道阱質(zhì)譜儀；Agilent 1260型系列高效液相色譜儀；Shimadzu-8A型高效液相制備色譜儀；SGW-1型自動(dòng)旋光儀。

原代巨噬細(xì)胞(BMDM)，南京醫(yī)科大學(xué)提供；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 化合物2的合成[14-15]

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，稱取化合物112.0 g(50.7 mmol)溶解于400 mL甲苯中，量取正丁基鋰(2.5 M)24.3 mL(60.9 mmol)，-78 ℃下緩慢滴加，滴畢，繼續(xù)反應(yīng)3 h，再稱取特戊醛5.67 g(66.0 mmol)，緩慢滴加，滴畢，繼續(xù)反應(yīng)1 h?；謴?fù)至室溫后緩慢滴加水20 mL淬滅反應(yīng)，濃縮，殘余經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=25/1～16/1，V/V) 純化得無(wú)色油狀液體9.1 g，產(chǎn)率72.5%;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.07(s, 1H), 7.73(d,J=16.4 Hz, 1H), 6.79(d,J=8.6 Hz, 1H), 5.02(d,J=11.2 Hz, 1H), 2.00(d,J=18.2 Hz, 1H), 0.88(s, 9H); MS(ESI)m/z: 243.9{[M+H]+} 。

(2) 化合物3的合成

稱取化合物29.0 g(36.9 mmol)和PCC 9.54 g(44.3 mmol)溶解于150 mL二氯甲烷中, 反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濃縮濾液，殘余經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=24/1,V/V) 純化得無(wú)色油狀液體6.6 g，產(chǎn)率74.1%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.68(dd,J=2.3 Hz, 0.6 Hz, 1H), 7.92(dd,J=8.4 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.82(dd,J=8.4 Hz, 0.6 Hz, 1H), 1.43(s, 9H); MS(ESI)m/z: 241.9{[M+H]+} 。

(3) 化合物4的合成[16]

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，稱取化合物36.5 g(26.8 mmol)，R-(+)-叔丁基亞磺酰胺3.6 g(29.5 mmol)和鈦酸四乙酯12.2 g(53.6 mmol)溶解于200 mL無(wú)水四氫呋喃中，76 ℃反應(yīng)16 h。反應(yīng)完畢后，除去大部分四氫呋喃，加入少量水，有大量白色固體析出，加入300 mL乙酸乙酯溶解，抽濾，分液，合并有機(jī)相，濃縮，殘余經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯= 24/1,V/V) 純化得淡黃色固體6.9 g，產(chǎn)率75.1%;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.72(d,J=2.2 Hz, 1H), 8.09(dd,J=8.3 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.29(d,J=8.3 Hz, 1H), 1.17(s, 9H), 1.13(s, 9H); MS(ESI)m/z: 344.7{[M+H]+}。

(4) 化合物5的合成

(5) 化合物6的合成

稱取化合物55.5 g(22.6 mmol)溶解于60 mL HCl/dioxane(4 N)混合溶劑中，室溫反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾餅用乙酸乙酯/石油醚(1/1，V/V)洗滌得淡黃色固體5.0 g，產(chǎn)率91.2%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.76(d,J=2.4 Hz, 1H), 8.52～8.48(m, 2H), 8.14(dd,J=8.3 Hz, 2.4 Hz, 1H), 7.50(d,J=8.4 Hz, 1H), 4.24(q,J=5.8 Hz, 1H), 0.94(s, 9H); MS(ESI)m/z: 242.1 {[M+H]+}。

(6) 化合物7的合成

稱取化合物64.9 g(20.0 mmol)，3-氯-4-氨基苯甲酸3.8 g(22.0 mmol)， HATU 9.1 g(24.0 mmol)溶解于80 mL DMF中，緩慢滴加DIPEA 7.8 g(60.0 mmol)，滴畢，繼續(xù)反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，溶解于200 mL乙酸乙酯中，依次用飽和碳酸氫鈉溶液、飽和食鹽水洗滌，分液，合并有機(jī)相，無(wú)水氯化鈉干燥，過(guò)濾，濃縮濾液，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯= 7/1～8/1,V/V) 純化得白色固體5.7 g，產(chǎn)率72.1%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.65(d,J=2.4 Hz, 1H), 8.06～7.97(m, 2H), 7.80(d,J=2.1 Hz, 1H), 7.58(dd,J=8.4 Hz, 2.1 Hz, 1H), 7.52(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.79(d,J=8.5 Hz, 1H), 5.90(s, 2H), 5.06(d,J=9.4 Hz, 1H), 0.93(s, 9H); MS(ESI)m/z: 395.2{[M+H]+}。

(7) 化合物8的合成[17-18]

稱取化合物75.5 g(13.9 mmol)， CuI 264.7 mg(1.39 mmol)， NaI 5.2 g(34.8 mmol)，N,N-二甲基乙二胺245.1 mg(2.78 mmol)溶解于60 mL 二氧六環(huán)中，置換氮?dú)?次后于110 ℃反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后，恢復(fù)至室溫，抽濾，用50 mL乙酸乙酯洗滌，濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯= 7/1～8/1,V/V)純化得白色固體3.8 g，產(chǎn)率61.1%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.75(d,J=2.2 Hz, 1H), 8.14(dd,J=8.3 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.99(d,J=9.5 Hz, 1H), 7.79(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.58(dd,J=8.5 Hz, 2.1 Hz, 1H), 7.39(d,J=8.3 Hz, 1H), 6.79(d,J=8.5 Hz, 1H), 5.90(s, 2H), 5.02(d,J=9.4 Hz, 1H), 0.93(s, 9H); MS(ESI)m/z: 444.1{[M+H]+}。

(8) 化合物9的合成[19-20]

稱取化合物83.6 g(8.1 mmol)，T21.7 g(8.9 mmol)， CuI 380.6 mg(1.62 mmol)，碳酸銫6.7 g(20.25 mmol)，L1817.5 mg(4.86 mmol)溶解于50 mL DMF中，置換氮?dú)?次后于 50 ℃反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾，收集濾液，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。

(9) 化合物10的合成

稱取TBTU 7.7 g(24.1 mmol)和DIPEA 4.1 g(31.7 mmol)加入到上一步反應(yīng)液中，緩慢滴加3.0 mL氨水(wt25%)反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，溶解于150 mL乙酸乙酯中，分別用100 mL飽和食鹽水、純水洗滌，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮，殘余經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯= 3/1,V/V) 純化得棕褐色固體1.8 g，兩步產(chǎn)率46.1%;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.10(d,J=2.3 Hz, 1H), 7.92(d,J=8.8 Hz, 1H), 7.79(d,J=2.3 Hz, 1H), 7.62(dd,J=8.3 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.49(s, 2H),7.21(d,J=8.8 Hz, 1H), 6.93(dd,J=8.1 Hz, 2.4 Hz, 1H), 6.86(d,J=8.7 Hz, 1H), 5.94(s, 2H), 5.68(d,J=6.6 Hz, 1H), 4.91(d,J=7.8 Hz, 1H), 3.66(q,J=5.8 Hz, 1H), 2.62(dd,J=11.6 Hz, 5.2 Hz, 1H), 2.16(dd,J=11.7 Hz, 6.6 Hz, 1H), 1.26(s, 9H), 0.79(s, 9H); MS(ESI)m/z: 504.1{[M+H]+}。

表1 合成化合物5反應(yīng)條件篩選

(10) 化合物11的合成[21-22]

稱取化合物71.5 g(3.0 mmol)，吡啶791 mg(10 mmol)溶解于15 mL二氧六環(huán)中，冰浴下，緩慢滴加三氟乙酸酐1.25 g(6.0 mmol)，滴畢，恢復(fù)至室溫，繼續(xù)反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入冰水淬滅反應(yīng)，溶解于80 mL乙酸乙酯中，用水(2×50 mL)洗滌，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮，殘余經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯= 5/1,V/V) 純化得白色固體921.5 mg，產(chǎn)率64.3%;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.91(d,J=2.8 Hz, 1H), 7.80(d,J=9.5 Hz, 1H), 7.74(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.55(dd,J=8.5 Hz, 2.1 Hz, 1H), 7.11(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.87(dd,J=8.4 Hz, 2.8 Hz, 1H), 6.79(d,J=8.4 Hz, 1H), 5.88(s, 2H), 5.56(d,J=6.1 Hz, 1H), 4.88(d,J=9.5 Hz, 1H), 3.68(q,J=6.2 Hz, 1H), 2.58(dd,J=14.6 Hz, 5.5 Hz, 1H), 2.28(dd,J=14.7 Hz, 6.9 Hz, 1H), 1.33(s, 9H), 0.88(s, 9H); MS(ESI)m/z: 486.3{[M+H]+}。

(11) 化合物12的合成[23]

稱取化合物11900 mg(1.8 mmol)溶解于5 mL二氯甲烷中，緩慢滴加三氟乙酸5 mL，滴畢，繼續(xù)反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，濃縮，殘余經(jīng)液相色譜分離(洗脫劑：水/乙腈=3/1，V/V) 純化得白色固體395.8 mg，產(chǎn)率51.1%;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.17(d,J=2.7 Hz, 1H), 8.10(d,J=8.7 Hz, 1H), 7.80(d,J=2.1 Hz, 1H), 7.67(s, 1H), 7.58(dd,J=8.5 Hz, 2.0 Hz, 2H), 6.78(d,J=8.5 Hz, 1H), 5.06(d,J=8.7 Hz, 1H), 4.95(d,J=7.9 Hz, 1H), 3.82(s, 2H), 3.05(dd,J=16.9 Hz, 6.4 Hz, 1H), 2.93(dd,J=16.9 Hz, 7.4 Hz, 1H), 0.95(s, 9H);13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 172.25, 170.60, 166.05, 148.17, 146.64, 143.11, 129.36, 128.26, 125.91, 122.24, 121.89, 119.54, 116.43, 114.49, 60.41, 41.40, 37.25, 35.63, 26.97, 26.97, 26.97; MS(ESI)m/z: 430.1{[M+H]+} 。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

以2,5-二溴吡啶為原料合成化合物2，由于吡啶2-位溴的活性明顯優(yōu)于5-位，加入丁基鋰后優(yōu)先與2-位溴反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)表明，得到的化合物2中有85%以上化合物為2-位溴被取代的化合物，僅有少量5-位溴被取代的化合物，且兩者極性有差異，經(jīng)柱層析可將兩者分離。在合成化合物6時(shí)，選用了不同的反應(yīng)條件來(lái)合成[24-25]，結(jié)果見表1，反應(yīng)條件1和2可直接將化合物3經(jīng)過(guò)一步反應(yīng)合成化合物6且產(chǎn)率均在86%以上，但合成的產(chǎn)物基本為外消旋體，后期進(jìn)行手性拆分比較繁瑣且收率較低。反應(yīng)條件3雖然經(jīng)過(guò)3步反應(yīng)才合成化合物6，且產(chǎn)率也僅為60.3%，但是合成的產(chǎn)物中有94.5%的構(gòu)型是所需要的，后期不需要進(jìn)行手性拆分，節(jié)約了成本和時(shí)間，所以選取了反應(yīng)條件3來(lái)合成。在合成化合物9時(shí)(表2)，起初以化合物7為底物，L1作為配體，用T2直接取代化合物7中吡啶5-位溴，經(jīng)一步反應(yīng)得到化合物9。但嘗試了不同溶劑、不同反應(yīng)溫度及不同反應(yīng)時(shí)間，均沒有得到目標(biāo)產(chǎn)物，原因可能是化合物7中吡啶5-位的溴反應(yīng)活性較差。由于碘的反應(yīng)活性強(qiáng)于溴，因此，考慮先將化合物7中吡啶5-位的溴替換為碘，然后再由T2將其取代，結(jié)果成功得到目標(biāo)化合物9，并且嘗試了不同的反應(yīng)溶劑，發(fā)現(xiàn)溶劑為DMF時(shí)產(chǎn)率最高。

Scheme 3

Scheme 4

表2 合成化合物9反應(yīng)條件篩選

2.2 反應(yīng)機(jī)理

由化合物4合成化合物5時(shí)(Scheme 3)，首先化合物4中的氮與DIBAL-H中的鋁配位(3-1)，由于化合物4含有手性且體積較大的叔丁基團(tuán)，DIBAL-H有兩個(gè)體積較大的二異丁基團(tuán)，因此，受到空間位阻的影響，兩者配位時(shí)只能從位阻較小側(cè)配位，形成構(gòu)型單一的配位化合物，同時(shí)，DIBAL-H中的氫只能從碳氮雙鍵的單側(cè)還原雙鍵，隨后，配位化合物結(jié)合溶劑中的質(zhì)子(3-3)，DIBAL-H殘基離去，因此可以得到構(gòu)型單一的化合物5。

由化合物7合成化合物9反應(yīng)過(guò)程比較復(fù)雜，提出了一個(gè)反應(yīng)機(jī)理。在合成化合物8時(shí)(Scheme 4)，首先N,N-二甲基乙二胺作為配體與CuI絡(luò)合，形成配體絡(luò)合物；然后化合物7中溴存在孤對(duì)電子，配體絡(luò)合物中銅存在空軌道，兩者配位結(jié)合，同時(shí)，絡(luò)合物中的碘進(jìn)攻吡啶5-位，形成一個(gè)四元環(huán)的中間過(guò)渡態(tài)，最后，溴離子與配體絡(luò)合物離去，碘取代吡啶5-位溴，這樣就可以得到化合物8。

2.3 細(xì)胞活性

原代巨噬細(xì)胞(BMDM)在LPS+ATP的刺激下，活化的Caspase-1將關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子IL-1β從無(wú)活性前體加工成熟，并促進(jìn)其分泌，因此，Caspase-1被認(rèn)為是炎癥過(guò)程的關(guān)鍵介質(zhì)，通過(guò)分析IL-1β的分泌量，可間接反映抑制劑對(duì)Caspase-1的抑制情況。因此，原代巨噬細(xì)胞(BMDM)在LPS+ATP的刺激下，分別加入不同濃度的化合物12，其中，LPS+ATP為空白對(duì)照組，ML132和Z-YVAD分別為兩種10 nM和10 μM陽(yáng)性參照，結(jié)果由圖2可見，化合物12對(duì)Caspase-1的抑制活性隨濃度的升高而逐漸增強(qiáng)。

圖2化合物12細(xì)胞活性

3 結(jié)論

采用廉價(jià)易得的2,5-二溴吡啶為原料，經(jīng)11步化反應(yīng)合成了新結(jié)構(gòu)的非肽類小分子化合物12，總收率為2.2%, 收率偏低，合成路線有待于進(jìn)一步優(yōu)化。采用ELISA法研究發(fā)現(xiàn)合成的化合物12對(duì)細(xì)胞(BMDM)的Caspase-1活性具有一定的抑制作用，但藥物活性還有待進(jìn)一步提高，為Caspase-1小分子抑制劑的研究提供了參考。