劉會(huì)麗 聶曉博 李艷紅 陳艷從 袁榴翼 劉曉蘭

(石家莊醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中醫(yī)基礎(chǔ)教研室，河北 石家莊 050599)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性免疫介導(dǎo)性疾病，其發(fā)病原因仍不十分清楚，臨床上多以氨基水楊酸類藥物或激素類藥物進(jìn)行治療，療效雖好卻不良反應(yīng)較多[1]。近年來，研究人員開始關(guān)注采用中醫(yī)藥治療UC，并認(rèn)為UC多為濕邪積滯所致，臨床常以健脾行氣利濕為法[2]。自擬化濕湯是我們治療UC的經(jīng)驗(yàn)方，由經(jīng)典方劑胃苓湯加減而來，臨床應(yīng)用其治療UC效果顯著。為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，本研究通過觀察化濕湯對(duì)UC模型大鼠的治療作用，并從抗炎、抗氧化損傷角度初步進(jìn)行機(jī)制探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠60只，無特定病原體(SPF)級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，喂飼滅菌常規(guī)飼料，自由飲用去離子水，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 化濕湯(藥物組成：炒蒼術(shù)8 g，炒白術(shù)8 g，制厚樸5 g，茯苓8 g，澤瀉5 g，陳皮5 g，炙甘草3 g，以上藥材均由河北省中醫(yī)院中藥房提供，并水煎濃縮至生藥含量2 g/mL)；美沙拉秦緩釋顆粒(上海愛的發(fā)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20143164)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 白細(xì)胞介素1β(IL-1β)及IL-10酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)；一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及髓過氧化物酶(MPO)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；CMax Plus光吸收型單功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；DM500生物顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 模型制備 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)取50只大鼠采用三硝基苯磺酸(TNBS)制作UC模型[3]。首先用10%水合氯醛大鼠腹腔注射麻醉，然后將直徑0.4 mm的膠管用石蠟油浸潤(rùn)后探入大鼠直腸內(nèi)部，深約7～8 cm，注入TNBS，給藥劑量為100 mg/kg，并將大鼠倒置30 s，使藥液充分滲入腸腔，最后將大鼠四肢捆扎，限制自由活動(dòng)5 d。

1.4.2 分組與給藥 第6 d造模成功后，將模型大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性藥物組(0.036 g/mL)、化濕湯低劑量組(0.5 g生藥/mL)、化濕湯中劑量組(1 g生藥/mL)、化濕湯高劑量組(2 g生藥/mL)，每組10只。另設(shè)10只大鼠為空白組。各組大鼠均按10 mL/kg灌胃，空白組及模型組予蒸餾水灌胃，陽性藥物組予0.036 g/mL美沙拉秦緩釋顆粒藥液灌胃，化濕湯低、中、高劑量組分別予化濕湯0.5、1.0、2.0 g/mL藥液灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃10 d。

1.4.3 取材 各組大鼠在末次灌胃后，禁食12 h，將大鼠腹腔麻醉后通過腹主動(dòng)脈取血，并分離血清備用。然后脫頸處死大鼠，剪取結(jié)腸組織，部分以4%多聚甲醛固定，-80 ℃冷凍保存。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 一般情況 從開始造模第1、3、6、9、12、15 d分別記錄各組大鼠的體質(zhì)量，并觀察毛色、糞便性狀等一般情況。

1.5.2 結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察 將4%多聚甲醛固定的結(jié)腸組織取出，石蠟包埋，切成4 μm組織切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度洗脫，蘇木素-伊紅(HE)染色，最后于100倍顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.5.3 血清炎癥因子檢測(cè) 對(duì)各組大鼠血清IL-1β、IL-10及NO水平進(jìn)行測(cè)定，IL-1β及IL-10采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，NO采用硝酸還原酶法進(jìn)行檢測(cè)，均按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.4 結(jié)腸組織氧化損傷檢測(cè) 各組取500 mg結(jié)腸組織置于勻漿管中打成勻漿，對(duì)結(jié)腸組織中MDA、SOD及MPO含量進(jìn)行測(cè)定，MDA采用硫代巴比妥酸法(TBA)檢測(cè)，SOD采用WST-1法檢測(cè)，MPO采用化學(xué)比色法檢測(cè)，均按試劑盒說明進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量及一般情況 空白組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，大鼠狀態(tài)正常，毛色光亮，糞便成形。模型組大鼠體質(zhì)量增加緩慢，精神萎靡不振，毛色枯槁，糞便稀溏，提示造模成功。陽性藥物組及化濕湯低、中、高劑量組大鼠在灌胃治療后體質(zhì)量增加情況、精神狀態(tài)、毛色及糞便性狀均好于模型組。各組大鼠造模后第1、3、6、9、12、15 d體質(zhì)量變化比較 見表1。

表1 各組大鼠造模后第1、3、6、9、12、15 d體質(zhì)量變化比較

由表1可見，模型組大鼠造模后第3、6、9、12、15 d的體質(zhì)量均低于空白組(P<0.05)。陽性藥物組及化濕湯中、高劑量組造模后第15 d體質(zhì)量均明顯高于模型組(P<0.05)，化濕湯低劑量組大鼠體質(zhì)量雖較模型組也有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；瘽駵邉┝拷M大鼠造模后第15 d體質(zhì)量明顯高于化濕湯低劑量組(P<0.05)，化濕湯中劑量組大鼠體質(zhì)量雖較化濕湯低劑量組比較，也有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)變化 空白組大鼠結(jié)腸黏膜隱窩結(jié)構(gòu)排列整齊，橫截面可見杯狀細(xì)胞。模型組大鼠結(jié)腸黏膜隱窩有分支，結(jié)構(gòu)扭曲，表面不平整。陽性藥物組大鼠結(jié)腸黏膜隱窩排列較整齊，僅上皮細(xì)胞有損傷。化濕湯低劑量組大鼠結(jié)腸黏膜隱窩排列雜亂，上皮細(xì)胞有明顯損傷?；瘽駵袆┝拷M大鼠結(jié)腸黏膜隱窩扭曲，上皮細(xì)胞損傷?；瘽駵邉┝拷M大鼠結(jié)腸黏膜隱窩排列較整齊，但可見上皮細(xì)胞損傷。見封3，圖1。

2.3 各組大鼠末次灌胃后血清IL-1β、IL-10及NO水平比較 見表2。

由表2可見，與空白組比較，模型組大鼠血清IL-1β和NO水平明顯升高(P<0.05)，IL-10水平明顯下降(P<0.05)。與模型組比較，陽性藥物組及化濕湯高劑量組大鼠血清IL-1β和NO水平明顯降低(P<0.05)，IL-10水平明顯升高(P<0.05)；化濕湯中劑量組大鼠血清IL-1β和NO水平較模型組明顯降低(P<0.05)，IL-10水平與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；化濕湯低劑量組大鼠血清IL-1β、IL-10及NO水平較模型組雖也都有改善，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與化濕湯低劑量組比較，化濕湯高劑量組血清IL-10水平升高(P<0.05)，NO水平降低(P<0.05)，化濕湯中劑量組血清NO水平降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠末次灌胃后血清IL-1β、IL-10及NO水平比較

2.4 各組大鼠末次灌胃后結(jié)腸組織MDA、SOD及MPO水平比較 見表3。

表3 各組大鼠末次灌胃后結(jié)腸組織MDA、SOD及MPO水平比較

由表3可見，與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中MDA和MPO水平均明顯升高(P<0.05)，SOD水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，化濕湯中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織中MDA和MPO水平均明顯降低(P<0.05)，SOD水平均明顯升高(P<0.05)；陽性藥物組MPO水平降低(P<0.05)，MDA和SOD水平與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；化濕湯低劑量組大鼠腸組織MDA、SOD及MPO水平雖較模型組也都有改善，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與化濕湯低劑量組比較，化濕湯高劑量組中MDA水平降低(P<0.05)，SOD升高(P<0.05)，化濕湯中劑量組MDA水平降低(P<0.05)。

3 討 論

UC又稱非特異性結(jié)腸炎，主要表現(xiàn)為大腸黏膜的慢性炎癥和潰瘍性病變。目前已知與UC有關(guān)的發(fā)病機(jī)制主要為氧化應(yīng)激、腸通透性增高、某些炎癥介質(zhì)或硫化物生成增加、短鏈脂肪酸氧化或甲基化減少、黏膜變性、糖胺聚糖含量異常改變等[4]，其中是氧化應(yīng)激和炎癥介質(zhì)釋放增加在臨床研究中均被明確證實(shí)與UC的發(fā)病密切相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸炎癥局部黏膜內(nèi)的活性氧代謝物過量產(chǎn)生，如過氧化氫、羥基自由基及氧化劑衍生物等，可能是炎癥性腸病的主要致病因素[6]。腸黏膜損傷與自由基的產(chǎn)生增多及內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)濃度的降低有關(guān)[7]。自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化是TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸黏膜損傷的機(jī)制之一[8]。MDA是氧化應(yīng)激的標(biāo)志產(chǎn)物，是脂質(zhì)過氧化過程的最終產(chǎn)物，自由基活性的增加會(huì)導(dǎo)致MDA的過量產(chǎn)生[9]。SOD被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)抑制氧自由基有害作用的重要的內(nèi)源性因子[10]，多項(xiàng)研究表明UC患者的結(jié)腸組織中SOD水平明顯下降[11]。MPO活性檢測(cè)對(duì)評(píng)價(jià)腸道炎癥也有重要意義，MPO常見于中性粒細(xì)胞，其活性與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)呈線性相關(guān)，在UC活動(dòng)期病例中，糞便中MPO水平顯著高于緩解期患者及正常對(duì)照者[12]。

多種炎癥細(xì)胞因子,如IL-1β、IL-10及NO在炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制中也扮演著重要的角色。臨床研究顯示，與健康人群相比UC患者的IL-1β及NO水平明顯增高，IL-10水平降低[13]。IL-1β作為促炎因子，廣泛參與了人體組織破壞、水腫形成等多種病理?yè)p傷過程，UC發(fā)生時(shí)其水平可明顯升高[14]。IL-10是具有免疫調(diào)節(jié)功能的抗炎細(xì)胞因子，主要由T淋巴細(xì)胞分泌，對(duì)炎性反應(yīng)有非特異性的抑制作用，研究表明IL-10的水平與UC的炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，促進(jìn)IL-10的表達(dá)能夠明顯減輕炎性反應(yīng)[15]。NO在炎性反應(yīng)過程中則扮演了雙重角色，既有促炎作用也有保護(hù)作用，當(dāng)組織細(xì)胞受到大量炎癥因子刺激時(shí)，NO也會(huì)大量產(chǎn)生，并且生成具有較強(qiáng)毒性的過氧亞硝酸鹽，對(duì)組織結(jié)構(gòu)和功能造成破壞[16]。

目前治療UC的首選藥物是5-氨基水楊酸、柳氮磺吡啶等，美沙拉秦緩釋顆粒是臨床常用的藥物之一，其可緩慢而勻速的釋放5-氨基水楊酸,從而達(dá)到抗炎的作用，因此本研究以此作為陽性藥物[17]。近年來，臨床上采用中醫(yī)藥治療UC的研究日益增多，并因其療效顯著、不良反應(yīng)輕微而受到了醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。UC屬中醫(yī)腸癖、泄瀉等范疇，認(rèn)為UC發(fā)病的中心環(huán)節(jié)在于脾虛濕困，多與濕邪侵及、恣食生冷、郁怒思慮、情志不遂等有關(guān)，脾胃受損，升降失司，運(yùn)化失常，濕熱內(nèi)生，水濕聚集，下注大腸，腸絡(luò)受損，腐敗化為膿血而痢下赤白，故治療應(yīng)以健脾益氣、祛濕止瀉為原則?；瘽駵怯伞兜は姆ā分形杠邷訙p而來，方中蒼術(shù)健脾燥濕，升陽散邪；白術(shù)燥濕健脾，利尿消腫；制厚樸溫中止痛，行氣化濕；茯苓利水消腫，滲濕健脾；澤瀉利水滲濕泄熱；陳皮理氣燥濕，可助蒼術(shù)、白術(shù)益氣，使脾氣以運(yùn)，濕邪得除；炙甘草補(bǔ)脾益氣，緩急止痛，調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏健脾行氣、祛濕止瀉之功。

以TNBS灌腸復(fù)制UC大鼠模型，依據(jù)的是TNBS在體內(nèi)與蛋白結(jié)合后成為抗原，可引起免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥的發(fā)生。本研究結(jié)果也顯示，與空白組大鼠比較，模型組大鼠血清中IL-1β及NO水平升高，IL-10水平降低，結(jié)腸組織中MDA及MPO水平升高，SOD水平降低。而經(jīng)過化濕湯灌胃治療后，大鼠血清中IL-1β及NO水平降低，IL-10水平升高，結(jié)腸組織中MDA及MPO水平降低，SOD水平升高，且高劑量效果更明顯。綜上所述，化濕湯治療UC模型大鼠療效確切，可明顯改善大鼠臨床癥狀，改善病變結(jié)腸組織病理形態(tài)，其作用機(jī)制可能與抑制炎性反應(yīng)，減輕氧化損傷有關(guān)，且高劑量效果更好。