包汝潑，翁士喬，李開剛

（寧波三生生物科技有限公司，浙江 寧波 315000）

烯丙孕素為三烯21碳甾體類孕激素，屬19-睪丸酮系列［1］，是一種口服給藥，且有孕激素活性的化合物，和所有甾體類化合物一樣，具有脂溶性，能進(jìn)入靶細(xì)胞，結(jié)合胞內(nèi)特異性受體［2］，以類似于天然孕酮的作用來抑制促性腺激素的釋放。烯丙孕素是后備母豬同期發(fā)情的理想藥品［3］，可用于大規(guī)模批次化的人工授精［4］。另外，烯丙孕素可顯著改善乏情后備母豬繁殖性能，提高其發(fā)情率和產(chǎn)仔數(shù)，且對(duì)后代仔豬的生產(chǎn)性能無(wú)影響［5-8］。烯丙孕素的研究與應(yīng)用已有近40年的歷史，目前國(guó)內(nèi)外研究該產(chǎn)品的廠家較多，但未見其有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法的公開報(bào)道。本研究中建立了一種簡(jiǎn)單易行、專屬性強(qiáng)、靈敏度高的烯丙孕素有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的高效液相色譜（HPLC）法，有助于烯丙孕素的質(zhì)量控制研究［9-10］?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀［美國(guó)安捷倫科技公司，包含二極管陣列檢測(cè)器（DAD）］；XS205型分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為十萬(wàn)分之一）。

1.2 試藥

烯丙孕素原料藥（批號(hào)分別為151019，151028），烯丙孕素對(duì)照品（批號(hào)為151008，純度為99.4%），雜質(zhì)A（批號(hào)為150701，純度為99.4%），雜質(zhì)B（批號(hào)為150701，純度為99.7%），雜質(zhì)C（批號(hào)為150701，純度為99.8%），結(jié)構(gòu)見圖1，均由寧波三生生物科技有限公司合成室制備。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析級(jí)，水為超純水。

圖1 烯丙孕素及雜質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chem ical structural formula of altrenogest and its impurities

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：GRACEAlltimaC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（60∶40，V/V）；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：316 nm；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 溶液制備

供試品溶液：取烯丙孕素原料適量，置50mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為0.5mg/mL的溶液，即得。

對(duì)照品溶液：精密量取供試品溶液1mL，置100mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

雜質(zhì)對(duì)照品貯備液：分別取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C對(duì)照品約10mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的溶液，即得。

對(duì)照品貯備液：取烯丙孕素對(duì)照品約10mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的溶液，即得。

系統(tǒng)適用性溶液：取烯丙孕素原料10mg，精密稱定，置20mL容量瓶中，分別精密加入雜質(zhì)A，B，C對(duì)照品貯備液1mL于容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液、系統(tǒng)適用性溶液及空白溶劑（流動(dòng)相），按擬訂色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果空白溶劑不干擾檢測(cè)，烯丙孕素理論板數(shù)大于5 000，烯丙孕素與各雜質(zhì)分離度良好。色譜圖見圖2。

圖2 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram s of system suitability test and specifcity test

破壞性試驗(yàn)［11-12］：1）未破壞，取樣品約10 mg，置20mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻，備用；2）酸破壞，取樣品約10mg，置20mL容量瓶中，加1mol/L鹽酸溶液2mL，室溫下放置2 h，加堿液調(diào)節(jié)溶液至中性，用流動(dòng)相定容，搖勻，備用；3）堿破壞，取樣品約10mg，置20mL容量瓶中，加1mol/L氫氧化鈉溶液2mL，室溫下放置2 h，加酸液調(diào)節(jié)溶液至中性，用流動(dòng)相定容，搖勻，備用；4）氧破壞，取樣品約10mg，置20mL容量瓶中，加30%雙氧水5mL，室溫下放置2 h，冷卻，調(diào)節(jié)溶液至中性，用流動(dòng)相定容，搖勻，備用；5）高溫破壞，取樣品約10mg，置20mL容量瓶中，加水適量，溶解，置100℃水浴中放置12 h，冷卻，用流動(dòng)相定容，搖勻，備用；6）強(qiáng)光破壞，取樣品約10mg，置20mL容量瓶中，加水適量，溶解，于光照強(qiáng)度4 500 lx條件下放置10 d，用流動(dòng)相定容，搖勻。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，經(jīng)熱、氧、高溫破壞后降解不明顯，經(jīng)酸、光破壞后有降解雜質(zhì)產(chǎn)生，但與主峰分離度良好。詳見圖3。

線性關(guān)系考察：分別取烯丙孕素、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、烯丙孕素對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度為10μg/mL的混合貯備液，精密量取混合貯備液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0mL，置10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣20μL測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，并計(jì)算各雜質(zhì)的校正因子。結(jié)果見表1。

表1 烯丙孕素及雜質(zhì)的線性關(guān)系考察結(jié)果和檢測(cè)限Tab.1 Linear relationship and detection lim it of altrenogest and its impurities

圖3 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram s of destructive tests

檢測(cè)限確定：取2.2項(xiàng)下各溶液，將其稀釋至一定濃度，以3倍信噪比（S/N=3）測(cè)定。烯丙孕素及各雜質(zhì)的檢測(cè)限見表1。

精密度試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為151008）對(duì)照品6份，精密稱定，用流動(dòng)相溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為0.5mg/mL的溶液。采用不同人員（實(shí)驗(yàn)員1，2）及設(shè)備（Agilent 1260-1型，Agilent 1260-2型）按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以各雜質(zhì)的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果實(shí)驗(yàn)員1采用Agilent 1260-1型HPLC儀所得結(jié)果的RSD為0，實(shí)驗(yàn)員2采用Agilent1260-2型HPLC儀所得結(jié)果的RSD為0.80%，表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取烯丙孕素原料藥（批號(hào)為151028）適量，依法制備供試品溶液，置室溫。精密量取20μL，分別在0，8，24，30h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的RSD為0.20%（n=3），表明烯丙孕素供試品溶液在30h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密量取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C對(duì)照品貯備液各4，5，6mL，置100mL容量瓶中，加入供試品溶液中，制成含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度80%，100%和120%的溶液各3份（共9份），分別進(jìn)樣20μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，帶入線性方程計(jì)算回收率，計(jì)算時(shí)扣除供試品已有的雜質(zhì)含量（3.37μg/mL）。結(jié)果見表2。

2.4 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

精密量取2.2項(xiàng)下供試品溶液及對(duì)照品溶液各20μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖至保留時(shí)間的2倍。結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

分別稱取烯丙孕素及雜質(zhì)A，B，C適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液，通過DAD檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在316 nm波長(zhǎng)處烯丙孕素與各雜質(zhì)的響應(yīng)最接近，且雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的相對(duì)響應(yīng)因子在0.9～1.1間，可不使用校正因子，易于簡(jiǎn)化方法。并對(duì)“專屬性試驗(yàn)”項(xiàng)下樣品進(jìn)行檢測(cè)，于316 nm波長(zhǎng)下相較其他波長(zhǎng)可檢測(cè)出更多未知雜質(zhì)，故選用316 nm作為有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)波長(zhǎng)。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of recovery tests（n=9）

表3 烯丙孕素有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果（%）Tab.3 Detection results of related substances of altrenogest（%）

3.2 色譜柱選擇

本試驗(yàn)中篩選了不同規(guī)格和品牌的C18色譜柱：GRACE Alltima silica C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Diamonsil C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Waters XTerra RP18柱（250mm×4.6mm，5μm），Agelavensil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），GRACE Alltima C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Welch Materials XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），OMNIBOND ORCA C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。由于雜質(zhì)A和烯丙孕素在色譜柱上的色譜行為極接近，而雜質(zhì)B、雜質(zhì)C和烯丙孕素的色譜行為差異較大，故重點(diǎn)考察雜質(zhì)A和烯丙孕素的分離度。經(jīng)篩選，上述色譜柱雜質(zhì)A分離度分別為無(wú)分離效果，1.36，無(wú)分離效果，1.01，1.20，1.73，無(wú)分離效果，1.63。故最終確定色譜柱為GRACE Alltima C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。

3.3 流動(dòng)相選擇

本試驗(yàn)中通過流動(dòng)相組成對(duì)比（甲醇和乙腈），發(fā)現(xiàn)使用甲醇時(shí)，烯丙孕素與各雜質(zhì)無(wú)法有效被洗脫分離，采用乙腈能使各雜質(zhì)完全分離。通過調(diào)整乙腈比例（50%，55%，60%，65%，70%）進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)果60%乙腈的分離效果最好，故選擇水-乙腈（40∶60，V/V）為流動(dòng)相。

3.4 耐用性考察

通過對(duì)流速、柱溫、流動(dòng)相比例進(jìn)行微調(diào)，考察本方法的耐用性，結(jié)果上述條件的調(diào)整不影響烯丙孕素的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果，表明該法靈敏度高、分離度好、專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于烯丙孕素有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。