王勝男，葛 菲 ，蔡田雨，齊世美 ，戚之琳

皖南醫(yī)學院1生物化學與分子生物學教研室，2安徽省活性生物大分子重點實驗室，3藥學院，4臨床醫(yī)學院，安徽蕪湖241002

胃癌是全世界范圍內(nèi)的高發(fā)腫瘤，雖然很多手段如手術、化療、放療等已經(jīng)廣泛應用于胃癌的治療，但是，由于胃癌的快速增殖及高轉移性特點，使得上述方法的治療效果并不盡如人意［1-2］。因此，探究胃癌增殖和轉移的內(nèi)在分子機制，尋找更加有效的治療策略是目前急需解決的問題。

研究表明許多天然活性產(chǎn)物具有抗腫瘤活性，可能成為癌癥治療的候選藥物［3-5］。二氫楊梅素（DHM）是一種廣泛存在于蛇葡萄屬植物中的天然黃酮類化合物，具有多種藥理學活性，如：抗炎［6］，抗腫瘤［7］，抗氧化［8］等。已有研究發(fā)現(xiàn)DHM能夠抑制卵巢癌的上皮細胞間質(zhì)轉化［9］；抑制TNF-α誘導的骨肉瘤細胞的轉移和侵襲［10］；通過p53相關信號途徑誘導胃癌細胞凋亡［2］。然而，DHM對胃癌細胞增殖和遷移的影響及內(nèi)在分子機制尚需進一步探究。因此，本研究擬檢測DHM對胃癌細胞BGC-823增殖和遷移的抑制作用，并進一步探究其可能的分子機制，為DHM的抗腫瘤機制提供新見解，為DHM用于胃癌的臨床輔助治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑

DHM（純度＞98%）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MMP-2，MMP-9 ELISA檢測試劑盒購自ABclone；Transwell購自 Millipore；高糖 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰酶購自Hyclone；青霉素和鏈霉素購自碧云天生物技術公司。E-cadherin，N-cadherin，p-Akt，Akt，stat3，β-actin 兔單克隆抗體及HSP70鼠單克隆抗體均購自CST；p-stat3和HMGB1鼠單克隆抗體購自SantaCruz。

1.2 細胞培養(yǎng)及傳代

胃癌BGC-823細胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基（含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），置于二氧化碳培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗研究。

1.3 CCK-8實驗

BGC-823細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，次日用不同濃度的DHM（0、40、60、80、100、120 μg/mL）處理細胞24 h，每組3復孔。藥物處理之后，分別加入CCK-8工作液10 μL/孔，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，全波段酶標儀MULTISKAN GO(Thermo)檢測各組吸光度A450nm。細胞存活率（%）=（A450nm實驗組-A450nm空白組）/（A450nm對照組-A450nm空白組）×100%。

1.4 克隆形成實驗

BGC-823細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，1000/孔。不同濃度的DHM（0、40、60、80 μg/mL）作用細胞72 h后更換新鮮培養(yǎng)基，二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1周，棄去細胞培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞1次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，然后用0.1%的結晶紫室溫染色30 min，PBS洗滌細胞3次之后，于倒置顯微鏡下計數(shù)各組克隆數(shù)并拍照，細胞數(shù)＞15個計為1個克隆。

1.5 Transwell實驗

Transwell小室置于24孔細胞培養(yǎng)板，BGC-823細胞消化后，用無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸，不同濃度DHM（濃度同上）處理細胞后，取200 μL細胞懸液加入小室上層，600 μL含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基加入小室下層（即24孔板內(nèi)）。二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室，用棉簽棒輕輕刮去小室濾膜內(nèi)表面的細胞，外表面的細胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，結晶紫染色后，于倒置顯微鏡下觀察穿過濾膜的細胞并計數(shù)。

1.6 ELISA實驗

BGC-823細胞提前1 d接種于12孔細胞培養(yǎng)板，不同濃度的DHM（濃度同上）分別處理細胞24 h。取各組細胞培養(yǎng)懸液用于測定MMP-2和MMP-9的水平，每組3復孔。具體操作方法按照試劑盒說明書進行。

1.7 Westernblot

BGC-823細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板，DHM處理細胞后，棄去細胞培養(yǎng)基，PBS洗滌后，加入細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min。12 500 r/min，4℃離心10 min提取胞內(nèi)總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒（碧云天生物技術公司）進行蛋白定量。蛋白樣品中加入loading buffer煮沸10 min，取等量蛋白進行SDSPAGE。電泳結束后轉移蛋白至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，加入相應一抗，置于搖床4℃孵育過夜。TBST洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫繼續(xù)孵育2 h，最后用化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白的表達情況，image J 1.52軟件半定量分析實驗結果。

1.8 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，Prism 6.0軟件分析實驗結果，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DHM抑制胃癌細胞的存活和克隆形成能力

CCK-8實驗檢測細胞存活率表明，DHM（40、60、80、100、120 μg/mL）處理后的胃癌細胞，其存活率分別為91.57%、66.58%、49.84%、36.04%、27.92%，顯著低于對照組（圖1）。統(tǒng)計分析表明，抑制作用呈現(xiàn)出濃度依賴性（組間比較P＜0.05）。根據(jù)CCK-8實驗結果，我們選取低、中、高（40、60、80 μg/mL）3個濃度的DHM用于后續(xù)實驗研究。克隆形成實驗結果顯示，DHM處理組與對照組相比，胃癌細胞的克隆形成能力被明顯抑制（圖2）。

圖1 DHM對胃癌細胞BGC-823活力的影響Fig.1 Effect of dihydromyricetin treatment on viability of gastric cancer BGC-823 cells(Mean±SD,n=3).**P＜0.01vscontrol.DHM:Dihydromyricetin.

圖2 DHM對胃癌細胞克隆形成能力的影響Fig.2 Effects of dihydromyricetin on colony-forming ability of gastric cancer BGC-823cells.**P＜0.01vscontrol.

2.2 DHM抑制胃癌細胞的遷移能力

Transwell實驗觀察其對胃癌細胞遷移能力的影響。結果表明，DHM處理組與對照組相比，遷移的細胞數(shù)量明顯下降，分別是對照組細胞遷移數(shù)的0.87、0.62、0.38倍，結果差異具有顯著統(tǒng)計學意義（圖3）。

圖3 DHM對胃癌細胞遷移的影響Fig.3 Effect of dihydromyricetin on migration of gastric cancer BGC-823 cells(Original magnification:×100).*P＜0.05,**P＜0.01vscontrol.

2.3 DHM抑制周期蛋白的表達和上皮細胞間質(zhì)轉化

DHM作用24 h后，周期蛋白Cyclin D1和E1的表達明顯降低（圖4A）。DHM明顯增強上皮細胞標志蛋白E-cadherin的表達，而對間質(zhì)細胞標志蛋白N-cadherin的表達則表現(xiàn)出顯著的抑制作用（P＜0.05，圖4B）。

圖4 DHM對周期蛋白（A）及上皮細胞間質(zhì)化反應標志蛋白（B）表達的影響Fig.4 Effect of dihydromyricetin(DHM)on cyclins expression and epithelialmesenchymal transition of BGC-823cells.*P＜0.05,**P＜0.01vscontrol.

3 討論

2.4 DHM降低MMP-2及MMP-9的水平

ELISA檢測DHM對MMP-2和MMP-9水平的影響發(fā)現(xiàn)，不同濃度的DHM作用胃癌細胞24 h，MMP-2和MMP-9的水平與對照組相比均顯著下降，統(tǒng)計分析表明，抑制作用亦呈現(xiàn)出濃度依賴性（P＜0.05，圖5）。

圖5 DHM對MMP-2和MMP-9表達的影響Fig.5 Effects of dihydromyricetin on the levels of matrix metalloenzyme-2(MMP-2)and MMP-9 in BGC-823 cells.*P＜0.05,**P＜0.01vscontrol.

2.5 DHM抑制Akt和stat3信號通路的活化

Western blot檢測Akt，stat3的磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，DHM處理的胃癌細胞，p-Akt，p-stat3的表達水平在8 h和12 h明顯下降，尤其以12 h下調(diào)最為顯著（圖6A）。不同濃度的DHM刺激胃癌細胞12 h后檢測Akt和stat3的磷酸化發(fā)現(xiàn)，DHM濃度依賴性的降低Akt和stat3的磷酸化，但對Akt和stat3總蛋白的表達并無明顯影響（圖6B）。

圖6 DHM對Akt/stat3信號途徑的抑制作用Fig.6 Inhibitory effects of dihydromyricetin on Akt/stat3 signaling pathways in BGC-823 cells.**P＜0.01vscontrol.

2.7 DHM下調(diào)HMGB1的表達

Western blot結果顯示，DHM處理的胃癌細胞，與對照組相比，HSP70的表達無明顯變化，而HMGB1的表達水平卻顯著下降（P＜0.01，圖7）。

圖7 DHM對HMGB1和HSP70表達的影響Fig.7 Effects of dihydromyricetin(DHM)on expression levels of high mobility group box protein 1(HMGB1)and heat shock protein70(HSP70)in BGC-823cells.**P＜0.01vscontrol.

胃癌是世界范圍內(nèi)的常見腫瘤，目前的臨床治療手段主要以手術和化療為主，但是由于癌細胞無限增殖和轉移重要生物學特征，上述治療方法難以獲得理想的治療效果。因此，抑制癌細胞的增殖和轉移越來越成為胃癌治療的重要策略。DHM為天然黃酮類化合物，具有抗炎，抗腫瘤，神經(jīng)保護等多種生物學作用［6,11-13］。

通過CCK-8、克隆形成和transwell實驗，我們發(fā)現(xiàn)，DHM能夠明顯抑制胃癌細胞的增殖和遷移。已有的研究表明，周期蛋白是參與細胞周期調(diào)控的重要蛋白質(zhì)，抑制細胞周期蛋白表達可減少細胞的增殖能力［14］。上皮細胞間質(zhì)轉化在腫瘤細胞轉移、侵襲中發(fā)揮重要作用，E-cadherin和N-cadherin是檢測上皮細胞間質(zhì)轉化的重要蛋白質(zhì)?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），作為主要的蛋白水解酶家族，在腫瘤細胞侵襲、轉移和腫瘤血管生成中起關鍵作用，而MMP-2和MMP-9則是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員［15-16］。在胃癌細胞中，DHM能否通過影響上述蛋白的表達，抑制胃癌細胞的增殖和轉移呢？我們的結果顯示，DHM不僅能夠下調(diào)CyclinD1、E1、MMP-2和MMP-9的表達，還能減弱上皮細胞間質(zhì)轉化。

Akt和stat3是胞內(nèi)非常重要的信號分子，可通過影響周期蛋白和遷移相關蛋白的表達，在調(diào)控腫瘤細胞的增殖、轉移和藥物抵抗方面發(fā)揮極其重要的作用［17-18］，許多藥物能夠通過抑制Akt和stat3信號分子的活化發(fā)揮抗腫瘤活性［19-22］。為了探究DHM調(diào)控周期蛋白和遷移相關蛋白表達的可能信號通路，我們采用Western blot實驗檢測了DHM對胃癌細胞中Akt和stat3磷酸化水平的影響。結果表明，DHM能夠明顯抑制胃癌細胞中Akt和stat3的磷酸化。綜上所述，DHM可通過抑制Akt和stat3信號途徑的激活，下調(diào)周期蛋白和基質(zhì)金屬酶的表達，阻止上皮細胞間質(zhì)轉化，抑制胃癌細胞的增殖和遷移。

HSP70和HMGB1在多種腫瘤組織和細胞中高表達，且與腫瘤的增殖、轉移密切相關［23-24］。也有報道表明，HMGB1通過Akt和stat3信號途徑促進腫瘤的遷移［12,25-26］，HSP70通過Akt信號途徑陽性調(diào)節(jié)轉化生長因子-α誘導的肝癌細胞遷移［27］。鑒于上述蛋白和Akt、stat3信號通路間的關系，我們進一步檢測了DHM對HSP70和HMGB1表達的影響。Westernblot結果表明，DHM能夠顯著抑制HMGB1的表達，但對HSP70的水平并無明顯影響。根據(jù)上述研究我們推測，HMGB1可能作為DHM抑制胃癌細胞增殖和遷移的分子靶點。

總之，DHM可能通過降低胃癌細胞中HMGB1的表達及Akt，stat3信號途徑的活化，抑制胃癌細胞的增殖和遷移，本研究為DHM的抗腫瘤機制提供了新見解。