陳世鈺，蘇 欣，劉俊平，石宇彤，吳敏敏，徐夢歧，張鳳梅，唐 敏

重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院//臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016

骨折是最常見的骨損傷情況之一，數(shù)據(jù)顯示有5-10%的骨折為難治性骨損傷，其主要是由于多種情況導致機體自身骨修復能力下降，這類患者可通過骨組織工程進行治療［1］。骨組織工程通過補充骨生長因子、移植骨替代品以及干細胞，提高骨缺損部位的骨再生能力，達到骨修復目的［1-2］。其中，間充質干細胞（MSCs）由于具有良好的自我增殖和多向分化能力，是骨組織工程重要種子細胞，但外源性間充質干細胞由于來源有限、增殖衰老和異質性等的問題［3-4］，臨床應用受限，目前骨組織工程主要采用無MSCs的治療［1,5］，也就是單獨或聯(lián)合使用骨支架和成骨生長因子（BMP2等）進行治療。然而，大量回顧性研究發(fā)現(xiàn)，無MSCs的骨組織工程的臨床治療效果不如預期，同時還因為劑量問題易出現(xiàn)異位成骨、強免疫反應等副作用［1-2,4］。因此，我們思考能否通過促進機體骨損傷部分、即自身的間充質干細胞數(shù)量增加，解決骨修復所需種子細胞來源問題，再結合促成骨因子、骨支架，促進難治性骨損傷的愈合呢？為此，我們在前期間充質干細胞成骨分化機制研究基礎上［6］，探討細胞因子對MSCs增殖、凋亡的影響和機制，期望能發(fā)現(xiàn)能刺激骨損傷部位自身間充質干細胞數(shù)量增多的細胞因子，以促進骨組織工程在臨床中的應用。

CCN3（NOV/CCN3）是由Ccn基因編碼的一種細胞外分泌蛋白，在人體多個組織中均有表達，參與調節(jié)細胞粘附、有絲分裂以及腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展等諸多生物過程［7-9］。近年來研究發(fā)現(xiàn)CCN3的表達與骨形成和發(fā)育密切相關［9-11］，且CCN3可作為Notch分泌型配體激活Notch信號通路［12］。課題組前期研究結果發(fā)現(xiàn)CCN3參與調控Notch對BMPs誘導的間充質干細胞成骨分化過程［13］，然而目前尚未見到關于CCN3對MSCs增殖、凋亡影響的相關報導。

小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）已被證實在體內外均具有MSCs的特性，其作為MSCs研究模型被越來越多的運用在MSCs相關研究中［14-16］。綜上，本研究擬以MEFs作為研究對象，利用重組腺病毒過表達及干擾CCN3表達，探討CCN3對MEFs增殖和凋亡的影響及其潛在作用機制。本研究結果將豐富調控MSCs生長發(fā)育機制的基礎研究結果，且可為解決骨組織工程中種子細胞來源問題提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 腺病毒、細胞株 小鼠胚胎成纖維細胞MEFs，人腎上皮細胞系HEK 293細胞由重慶醫(yī)科大學臨床檢驗診斷學重點實驗室保存。過表達綠色熒光蛋白腺病毒（Ad-GFP）、過表達紅色熒光蛋白腺病毒（Ad-RFP）、過表達CCN3腺病毒（Ad-CCN3）、干擾CCN3腺病毒（AdsiCCN3）均由芝加哥大學何通川教授饋贈。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基購自重慶賽米克公司；胎牛血清（FBS，太倉依科賽）；Polybrene以及茜素紅S（Sigma）；堿性磷酸酶染色試劑盒、Western blot相關試劑及IP細胞裂解液（碧云天）；RNA提取試劑盒（奕杉）；RT-PCR試劑盒和SYBR GreenⅠ（TaKaRa）；CCN3 ELISA試劑盒以及兔抗鼠ERK1+2、p-ERK1+2抗體（Abcam）；PVDF膜以及化學發(fā)光HRP底物（Millipore）；鼠抗鼠β-actin單克隆抗體（鐘鼎）；兔抗鼠PCNA、Bax、Bcl-2以及乙?；疕3K9抗體（CST）；兔抗鼠Cyclin E、Cyclin B1抗體（萬類生物科技）；牛血清粉BSA（索萊寶）；胰蛋白酶以及羊抗兔、羊抗鼠二抗（中杉金橋）；磷酸鹽粉（博士德）；引物分別于北京擎科公司以及上海生工生物工程公司設計及購買。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 小鼠間充質干細胞MEFs、人腎上皮細胞系HEK 293細胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素（P/S）的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、5% CO2飽和濕度條件的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞貼壁融合至70%～80%（對數(shù)生長期）時，用0.25%胰蛋白酶消化繼續(xù)傳代。

1.2.2 腺病毒處理細胞 取對數(shù)生長期MEFs鋪板（24孔板，5×105/孔）檢測病毒滴度。觀察感染率約為30%的對應孔病毒滴度并在熒光顯微鏡下拍照。確定病毒滴度后，培養(yǎng)MEFs至30%密度左右，加入Polybrene穿孔素（4μL/500μL培養(yǎng)基），再按所測病毒滴度處理細胞，加病毒6～8 h后更換培養(yǎng)基為無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基。綠色熒光于處理后24 h在熒光顯微鏡下觀察熒光，紅色熒光于處理后36小時在熒光顯微鏡下觀察熒光并拍照。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞周期及細胞凋亡 利用Ad-GFP、Ad-RFP、Ad-CCN3、Ad-siCCN3腺病毒感染細胞，2d后進行細胞周期及細胞凋亡檢測。

細胞周期檢測：吸去培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化細胞，冰PBS洗滌細胞3次，隨后離心沉淀細胞，棄上清，用70%預冷的乙醇重懸，4℃過夜，最后經(jīng)流式細胞儀，采用碘化丙啶（PI）DNA染色法檢測細胞周期情況。

細胞凋亡檢測：吸去培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化細胞，冰PBS洗滌細胞3次，離心沉淀細胞，棄上清，PBS重懸，最后經(jīng)流式細胞儀，綜合采用Annexin-ⅤAPC-A/DAPI PD450-A雙染法以及AnnexinV-FITC單染法檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 ELISA實驗 采用Ad-GFP、Ad-RFP、Ad-CCN3、Ad-siCCN3腺病毒感染細胞48 h后收集細胞培養(yǎng)上清液，2000g離心10 min后取上清液按照試劑盒說明書進行ELISA實驗。具體步驟如下：將所有材料和試劑放至室溫后稀釋樣本至試劑盒檢測的線性范圍內，孔板內加入50μL樣本或標準品，隨后加入50μL抗體混合物密封，400 r/min搖板室溫孵育1 h，350 μL1×洗液/孔，洗滌3次后，加入100μLTMB底物，400 r/min的搖板機避光室溫孵育10 min后，每孔加入100μL終止液，振蕩混勻1min，酶標儀測定在450nm吸光度。

1.2.5 RNA提取、逆轉錄和qRT-PCR檢測細胞mRNA表達 腺病毒感染細胞后，于培養(yǎng)第3天時利用RNA快提取試劑盒提取RNA，并測定RNA濃度。使用逆轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉錄為cDNA，之后進行RTPCR實驗，并采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。RT-PCR使用的引物序列見表1。

1.2.6 總蛋白提取和Western blot檢測蛋白表達水平總蛋白提?。合俨《靖腥炯毎?，于細胞培養(yǎng)至第3天時提取蛋白質。棄去培養(yǎng)基，預冷PBS洗3次，向培養(yǎng)板中加1mL預冷PBS，刮下細胞，吸至1.5 mL EP管中，5000 r/min，4 ℃，5min，棄上清，加入細胞蛋白裂解液100μL/管，混勻，每溶10 min震蕩1次，共3次，12 000 r/min，4℃，20 min，取上清90μL至新的EP管中，留取10μL測蛋白濃度備用，90μL中加入22.5μL 5×蛋白上樣緩沖液，混勻，封口膠封口，沸水浴5～10min，-20℃保存。

表1 實時定量PCR引物表Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

Western blot實驗：根據(jù)蛋白相對分子質量配膠，加入適量蛋白進行電泳，恒壓濃縮（90 V）和分離（120 V）蛋白，恒流（210 mA）將蛋白轉移至PVDF膜上，取出PVDF膜，BSA或5%脫脂牛奶37℃封閉2 h，然后加入相對應的一抗（1∶1000稀釋）于4℃放置12～16 h。在震蕩儀上用TBST洗膜10 min/次，一共3次。然后加入相對應的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG二抗（1∶5000稀釋）于37℃孵育1 h，TBST洗膜10 min/次，最后于化學發(fā)光成像儀成像。顯色結果用Image Lab軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

各實驗均獨立重復至少3次，采用GraphPad Prism 5軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，使用單因素方差分析進行多組間比較，t檢驗進行組間兩兩比較，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 腺病毒效果鑒定

熒光顯微鏡下觀察，結果顯示Ad-GFP、Ad-CCN3加入約24 h后，可在MEF細胞中觀察到明顯的綠色熒光（圖1A左），且RT-qPCR結果表明，與Ad-GFP對照組相比，Ad-CCN3處理組細胞內CCN3表達量明顯增高（圖1B，P＜0.05）；Ad-RFP、Ad-siCCN3加入約36 h后，MEF細胞中可以觀察到明顯的紅色熒光（圖1A右），RT-qPCR結果顯示，與Ad-RFP對照組相比，Ad-siCCN3組CCN3表達量降低（圖1C，P＜0.001）。

圖1 腺病毒感染間充質干細胞情況Fig.1 Mouse embryonic fibroblasts(MEFs)transfected with different adenovirus vectors for CCN3 over-expression or knockdown.A:MEFs with CCN3 over-expression and knockdown under fluorescence microscope.B:CCN3 mRNA expression level in MEFs over-expressing CCN3 detected by RT-qPCR(*P＜0.05).C:CCN3 mRNA expression level in MEFs with CCN3 knockdown detected by RT-qPCR(***P＜0.001).

2.2 CCN3促進間充質干細胞增殖

與Ad-GFP對照組相比，Ad-CCN3組S期細胞百分比明顯增加，增殖指數(shù)PI指數(shù)明顯增加（圖2A、B，P＜0.01）；Ad-siCCN3組，細胞周期無明顯變化（圖2C、D，P＞0.05）。腺病毒感染36 h后提取總蛋白檢測經(jīng)典增殖標志蛋白PCNA、G1/S期周期蛋白標志物Cyclin E和G2/M期標志蛋白Cyclin B1表達，結果顯示與Ad-GFP對照組相比，Ad-CCN3組PCNA表達明顯增加，Cyclin E表達顯著增加，而Cyclin B1表達減少（圖2F，P＜0.05），Ad-siCCN3組則無明顯變化（圖2E、F）。

圖2 CCN3對細胞增殖的影響Fig.2 Effect of CCN3 over-expression or knockdown on proliferation of MEFs.A,B:Effect of CCN3 overexpression on cell cycle detected by flow cytometry.C,D:Effect of CCN3 knockdown on cell cycle detected by flow cytometry.E,F:Expression levels of PCNA,cyclin E and cyclin B1 in MEFs with CCN3 over-expression or knockdown detected by Western blotting.*P＜0.05,**P＜0.01.

2.3 CCN3抑制間充質干細胞凋亡

Ad-CCN3組與Ad-GFP對照組相比，細胞凋亡百分比顯著降低，其中晚期凋亡細胞百分比降低更為明顯（圖3A、C，P＜0.05）；Ad-siCCN3組與Ad-RFP對照組相比，細胞凋亡百分比增加（圖3B、D，P＜0.05）。隨后腺病毒處理36 h后，提取細胞總蛋白檢測凋亡抑制蛋白Bcl-2、凋亡促進蛋白Bax表達變化情況。與對照組相比，Ad-CCN3組Bax蛋白表達減少（圖3E、F，P＜0.05），Bcl-2表達顯著增加（圖3E、F，P＜0.01），Add-siCCN3組Bax表達無明顯變化（圖3E、F，P＞0.05），Bcl-2蛋白表達減少（圖3E、F，P＜0.01）。

圖3 CCN3對細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of CCN3 over-expression or knockdown on MEF apoptosis.A,C:The effect of overexpression of CCN3 on apoptosis was detected by flow cytometry(*P＜0.05).B,D:The effect of Ad-siCCN3 on apoptosis was detected by flow cytometry(*P＜0.05).E,F:The expression levels of pro-apoptotic protein Bax and anti-apoptotic protein Bcl-2 after transfection by CCN3 and siCCN3 viruses detected by Western blotting(*P＜0.05,**P＜0.01).

2.4 不同處理下CCN3分泌情況

ELISA結果顯示：MEFs細胞為低密度時（30%）CCN3濃度在為0.27 ng/mL左右，中等密度（60%）CCN3濃度為0.97～1.05 ng/mL左右，高密度（90%）CCN3濃度為16.04～27.71 ng/mL左右（圖4A）。隨后ELISA試劑盒檢測腺病毒感染后CCN3表達情況結果顯示：以高細胞密度組CCN3表達為對照，Ad-CCN3組CCN3濃度增加至849.62～1629.48 ng/mL之間，而siCCN3組CCN3的濃度在9.09～22.5 ng/mL之間，略低于正常水平（圖4B）。

圖4 不同情況下CCN3表達水平Fig.4 CCN3 secretion level in MEFs cultured under different conditions or with CCN3 over-expression or knockdown.A:CCN3 secretion levels by MEFs cultured at different cell densities(30%,60%,and 90%)detected by ELISA.B:CCN3 secretion levels in MEFs cells with CCN3 over-expression or knockdown detected by ELISA.

2.5 CCN3抑制經(jīng)典Notch信號通路

與Ad-GFP對照組相比，Ad-CCN3處理組Notch1 mRNA表達增加（圖5A，P＜0.001），Hey1 mRNA表達減少（圖5B，P＜0.01），p300 mRNA表達減少（圖5C，P＜0.05），組蛋白H3K9表達減少（圖5D、E，P＜0.01）；Ad-siCCN3組結果則剛好相反，與Ad-RFP對照組相比，Notch1 mRNA表達減少（圖5A，P＜0.05），Hey1和p300 mRNA表達明顯增加（圖5B、C，P＜0.05；P＜0.01），組蛋白H3K9表達增加（圖5D、E，P＜0.05）。此外RTPCR結果顯示，過表達CCN3能抑制DLL1 mRNA表達（圖5F，P＜0.01），干擾CCN3可促進DLL1mRNA表達（圖5F，P＜0.05），而過表達DLL1抑制CCN3 mRNA表達（圖5G，P＜0.05）。

圖5 CCN3抑制經(jīng)典Notch信號通路Fig.5 CCN3 inhibits the classical Notch signaling pathway.A:The influence of Ad-CCN3 and Ad-siCCN3 on the mRNA expression of Notch1 was detected by RT-qPCR(*P＜0.05,***P＜0.001).B:RT-qPCR was used to detect the effects of overexpression of CCN3 and siCCN3 on Hey1 mRNA expression(*P＜0.05,**P＜0.01).C:RT-qPCR was used to detect the effects of overexpression of CCN3 and siCCN3 on p300 mRNA expression(*P＜0.05,**P＜0.01).D,E:The protein expression levels of acetylated histone H3K9 after transfection of CCN3 and siCCN3 viruses determined by Western blot(*P＜0.05,**P＜0.01).F:RT-qPCR was used to detect the effects of overexpression of CCN3 and siCCN3 on DLL1 mRNA expression(*P＜0.05,**P＜0.01).G:RT-qPCR was used to detect the effects of overexpression of DLL1 on CCN3 mRNA expression(*P＜0.05).

2.6 CCN3激活ERK/MAPK信號通路

與Ad-GFP對照組相比，Ad-CCN3處理組ERK1+2和p-ERK1+2蛋白表達增加（圖6，P＜0.001，P＜0.01）；與Ad-RFP對照組相比，Ad-siCCN3組ERK1+2蛋白表達量無明顯變化（圖6，P＞0.05），p-ERK1+2蛋白表達減少（圖6，P＜0.05）。

圖6 CCN3激活ERK/MAPK信號通路Fig.6 CCN3 over-expression activates the ERK/MAPK signaling pathway in MEFs.A,B:Protein expression levels of ERK1+2 and p-ERK1+2in MEFs with CCN3 over-expression or knockdown determined by Western blotting.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

3 討論

近年來骨組織工程作為難治性骨損傷的重要治療手段，越來越受到臨床重視。其通過各種方式促進骨損傷部位的間充質干細胞成骨分化，實現(xiàn)骨修復［17］，因此，保障骨損傷部位間充質干細胞的數(shù)量對骨修復能力至關重要，然而外源性間充質干細胞由于存在來源有限、異質性以及增殖衰老發(fā)育機制不清楚等問題限制了其使用［18-19］，因此，擬在前期對間充質干細胞成骨分化的研究基礎上，進一步探討間充質干細胞增殖的調控機制，探索能夠促進機體自身間充質干細胞數(shù)量增多的方法，為改進骨組織工程治療策略、提高骨組織工程的臨床治療效果提供思路和依據(jù)。

腎母細胞瘤過表達因子CCN3近年來被發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及骨再生過程中發(fā)揮重要調控作用［20-22］。前期研究發(fā)現(xiàn)，DLL1/Notch信號通路能明顯促進BMPs調控的間充質干細胞成骨分化［23］，而CCN3卻明顯抑制間充質干細胞成骨分化［13］。因為增殖和分化是細胞功能兩個不同的方向，因此，我們考慮CCN3在這一過程中，是否是作為間充質干細胞增殖因子存在。查閱文獻，發(fā)現(xiàn)有研究結果表明CCN3可促進牙髓干細胞DPSCs以及內皮細胞的增殖［21,24］，而也有學者的研究結果所得結論恰好與之相反［25-27］，這間接提示CCN3調控細胞增殖機制復雜，值得進一步研究。

本研究利用重組CCN3腺病毒感染細胞，探究CCN3對細胞增殖的影響及潛在機制。結果顯示：上調MEFs中CCN3表達，能夠顯著促進細胞增殖，這與CCN3對Balb/c 3T3成纖維細胞作用中的發(fā)現(xiàn)一致［28］，而這一過程中，G1/S期標志周期蛋白Cyclin E的表達增加，G2/M期Cyclin B1的表達則是下調的，提示CCN3可能是通過影響細胞G1/S期調控細胞增殖。然而與預期結果不一致的是干擾CCN3表達后對細胞增殖無明顯影響。考慮到CCN3是一種分泌型蛋白，其發(fā)揮調控作用受到其濃度的影響，且已有研究表明不同濃度CCN3對成骨分化和細胞增殖作用不同［10,28-29］，我們進一步檢測不同處理情況下CCN3的表達量，ELISA結果顯示，MEFs中CCN3的基礎表達量約為21.87ng/mL，腺病毒處理后可顯著上調細胞CCN3分泌，約為基礎表達量的60倍，然而Ad-siCCN3感染后僅在細胞基礎表達量上輕微下調CCN3表達，因此我們猜測Ad-siCCN3組結果與預期不符的原因可能由于是腺病毒下調CCN3表達量不足以影響細胞增殖，這一猜想尚需要進一步設計實驗驗證。研究中，我們還發(fā)現(xiàn)過表達CCN3能夠抑制MEFs細胞凋亡，提示CCN3同時還通過抑制細胞凋亡的途徑增加細胞數(shù)量。

那么CCN3是通過什么途徑調控MEFs增殖的呢？因為CCN3已經(jīng)被證實可與Notch1結合，是Notch信號通路的非經(jīng)典配體之一［12］。于是我們首先檢測了CCN3對Notch信號通路的激活，RT-PCR結果顯示，過表達CCN3能促進Notch1 mRNA表達，而siCCN3則抑制其表達，證實CCN3的確可激活Notch1。然而進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達CCN3明顯抑制了Notch經(jīng)典通路中靶基因Hey1和p300 mRNA表達，Western blot結果也顯示組蛋白乙酰化水平明顯下降；干擾CCN3后結果剛好相反，提示過表達CCN3雖然激活Notch1，但在功能上卻抑制了經(jīng)典的Notch信號通路。前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Notch信號通路可激活MAPK［30-31］，且MAPK通路與細胞增殖密切相關［32-33］，因此我們進一步檢測了MAPK通路下游蛋白變化情況，Western Blot結果顯示，過表達CCN3能夠促進ERK1+2以及p-ERK1+2蛋白表達，這提示CCN3可能通過上調MAPK信號通路調控細胞增殖和凋亡。

綜上所述，本研究在前期研究基礎上，對Notch分泌型配體CCN3在MEFs增殖和凋亡中的作用和機制進行了初步探討，研究結果顯示CCN3可能與Notch1結合，通過抑制DLL1/Notch信號通路，激活MAPK信號通路，促進細胞增殖，抑制凋亡，從而有效增加細胞數(shù)量。本結果提示CCN3有望作為MSCs的有效促增殖因子應用于骨組織工程中。但在骨組織工程中，如何合理使用CCN3，與骨形成蛋白BMPs、骨支架等協(xié)同作用，促進骨損傷部位骨再生，尚需進一步研究。