章 坤，時哲敏，任 怡，韓曉輝，王敬朝，洪 偉

天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，天津 300070

骨質(zhì)疏松癥是一類在絕經(jīng)后婦女中發(fā)病率高、治愈率低的慢性疾病。其發(fā)病機(jī)制主要是由于破骨細(xì)胞引起的過度骨吸收、成骨細(xì)胞減少引起的骨形成減少，進(jìn)而骨重量和骨骼穩(wěn)態(tài)被破壞；其特征表現(xiàn)為骨密度降低、骨微細(xì)結(jié)構(gòu)改變，最終可能導(dǎo)致骨折［1］。隨著社會經(jīng)濟(jì)和健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展人類壽命延長并進(jìn)入老齡化，老年人骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率以及由其導(dǎo)致的骨折隨年齡的增長而增加。在中國大約有8800萬患者患有骨質(zhì)疏松癥，在美國大約有5000萬患者［1-4］。此外，將近16%的骨質(zhì)疏松癥患者一生中會經(jīng)歷一次骨折。骨質(zhì)疏松癥骨折給患者本人和社會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會問題?；颊咄呀?jīng)發(fā)生了骨質(zhì)疏松癥甚至是非常嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松癥后才去就診。目前雖然開發(fā)了治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，但是也存在臨床應(yīng)用的局限性。本項目的研究目的是通過深入探究骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的分子機(jī)理，為骨質(zhì)疏松癥的預(yù)警和早期診斷及開發(fā)針對骨質(zhì)疏松癥的精準(zhǔn)治療藥物提供理論和實驗依據(jù)。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度超過200個核苷酸但未翻譯成蛋白質(zhì)的RNA，這一限制將lncRNAs 與 小 RNAs（miRNAs）、小 干 擾 RNAs（siRNAs）、核仁小RNA（snoRNA）和其他短RNA區(qū)分開來。lncRNAs起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能［5-6］。然而，近年來越來越多針對lncRNAs的研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs可以通過多種層面調(diào)控基因的表達(dá)水平，進(jìn)而參與多種生理和病理過程［7-14］。lncRNA Kcnq1重疊轉(zhuǎn)錄物1（Kcnq1ot1）是一個位于Kcnq1位點、具有物種同源性、由RNA聚合酶II催化合成的長鏈非編碼RNA，其人轉(zhuǎn)錄本全長91 671核苷酸，定位于人染色體11p15.5；而小鼠轉(zhuǎn)錄本全長83437核苷酸，定位于小鼠7號染色體［15］。Kcnq1ot1是一個印記基因，即只表達(dá)父源等位基因。其轉(zhuǎn)錄本調(diào)控位于同一印記基因簇的其他基因父源拷貝的沉默［15］。近年來，越來越多的文獻(xiàn)報道Kcnq1ot1與包括淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、心肌病等在內(nèi)的多種疾病相關(guān)［16-21］。盡管有文獻(xiàn)報道lnc-KCNQ1OT1可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化［22-23］，然而其在骨質(zhì)疏松癥以及破骨細(xì)胞分化過程中的表達(dá)及作用仍不明確。本研究致力于解決以上問題，擬檢測lnc-Kcnq1ot1在多種骨質(zhì)疏松模型、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化過程中的表達(dá)；并探究其在成骨和破骨過程中的作用，為臨床骨質(zhì)疏松癥的治療提供新靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7、小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1和HEK293T細(xì)胞均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞BMMs從6～8周齡的C57BL/6雄性小鼠的股骨中提取。C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司。實驗小鼠在天津醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心繁育，所有的程序按照天津醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心的操作規(guī)范流程進(jìn)行。DMEM高糖、MEM-α培養(yǎng)基、OPtI-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑和核漿分離提取試劑盒（英濰捷基）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo fisher）；Trizol、SYBG（Takara）；重組人核因子κB受體活化因子配體（RANKL）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）（派普泰克）。TRAP染色試劑盒、抗壞血酸、β-甘油磷酸酯和地塞米松（Sigma）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞提取、培養(yǎng)及破骨誘導(dǎo) BMMs細(xì)胞提取方法；取6～8周齡雌性C57小鼠，頸椎脫臼處死小鼠。用75%乙醇消毒腹部和后腿。固定小鼠四肢，在腹部中線切開一個切口，去除皮后用剪刀分離出后腿，用75%乙醇以及高壓滅菌過的1×PBS清洗干凈后腿。用剪刀剔除骨頭上的所有肌肉組織，分離出股骨，分別切斷股骨的兩端，在10 mL細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入20 mL預(yù)熱好的MEMα完全培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清FBS和1%青鏈霉素），用1mL注射器吸取MEMα完全培養(yǎng)基反復(fù)將針頭插入髓腔進(jìn)行沖洗，直至髓腔呈現(xiàn)白色，將細(xì)胞培養(yǎng)皿中含有骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)液收集到50 mL離心管中，吹散細(xì)胞使細(xì)胞懸浮，用70目鋼目網(wǎng)過濾細(xì)胞懸浮液，取90μL進(jìn)行臺盼藍(lán)染色并細(xì)胞計數(shù)，觀察活細(xì)胞數(shù)量；1500 r/min離心3 min，棄去上清，加入適量預(yù)熱好的完全培養(yǎng)液和25 ng/mL的M-CSF重懸細(xì)胞后鋪板，培養(yǎng)3 d后換液，此時在完全培養(yǎng)液中加入25 ng/mL的MCSF和100 ng/mL的sRANKL誘導(dǎo)細(xì)胞，1次/2 d換液，誘導(dǎo)6～8 d直至細(xì)胞出現(xiàn)融合。RAW264.7細(xì)胞用含10% FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用100 ng/mL的sRANKL誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞，1次/2 d換液，共誘導(dǎo)4 d。MC3T3-E1細(xì)胞用含10% FBS和1%青鏈霉素的MEM-α培養(yǎng)基在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)成骨分化時，在培養(yǎng)液里加入50 μg/mL抗壞血酸（維生素C），10 mmol/mL β-甘油磷酸酯和10-7mmol/mL地塞米松。1次/2d換液。

1.2.2 TS（鼠尾懸吊）誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型 選用6～8周雄性C57BL/6小鼠20只，實驗室常規(guī)喂養(yǎng)1周后，將小鼠單籠飼養(yǎng)，考慮到鼠尾懸吊的致死性以及成功率，其中14只鼠尾懸吊（另外6只作為對照），前肢著地，后肢懸空，身體與平面呈30°夾角。小鼠能自由進(jìn)食進(jìn)水，28d即可建立骨質(zhì)疏松模型。

1.2.3 OVX鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型建立 選用12～14周齡雌性C57BL/6小鼠14只，實驗室常規(guī)喂養(yǎng)1周后，其中8只進(jìn)行卵巢去除手術(shù)（另外6只作為對照）。用7.7 μL/g的烏拉坦腹腔注射麻醉小鼠。取俯臥位，手術(shù)區(qū)備皮，碘伏消毒，在小鼠髂嵴頂部外上方1 cm左右，腰椎骶棘肌兩側(cè)做縱向切口長約0.8 cm，打開后腹膜，切除雙側(cè)卵巢，清理傷口后分兩層縫合皮膚和肌層。卵巢為粉紅色顆粒狀組織，多被其周圍脂肪組織所掩蓋，術(shù)中需撥開這些組織，方能將其顯露。對照組手術(shù)方法與實驗組相同，但打開后不切除卵巢。術(shù)后正常飲食飲水，6月即可建立骨質(zhì)疏松模型。

1.2.4 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞 靶向Kcnq1ot1的siRNAs由上海吉瑪基因公司提供si-NC:UUCUCCGAACGUGU CACGUTT；si-lncKcnq1ot1-1#：GGGAAUCUGGUC UAAUGAATT；si-lncKcnq1ot1-2#：CCUGGUGAAG GUACUAAAUTT；si-lncKcnq1ot1-3#：GCCUGUGU CUGUCAUAGAATT；si-lncKcnq1ot1-4#：GCUGCUC ACUUAGUAACUATT；待六孔板細(xì)胞密度達(dá)到50%～70%即可轉(zhuǎn)染siRNAs，轉(zhuǎn)染前將六孔板換為無雙抗完全培養(yǎng)基。A液：250μLopti-MEM＋3μLsiRNA；B液：250 μLopti-MEM＋5 μLLipofectamine RNAiMAX；混勻，離心靜置5 min后，將B液加入至A液，混勻，離心靜置20 min。將AB液復(fù)合物加入到每孔培養(yǎng)液中，輕輕搖動六孔板混勻。37℃、5% CO2培養(yǎng)。

1.2.5 慢病毒構(gòu)建 設(shè)計并合成Kcnq1ot1的shRNAs序列：Kcnq1ot1-Mus-31 978-F：GATCCCCCCTGGAGA CTTGCCCTATTTTCAAGAGAAATAGGGCAAGTC TCCAGGTTTTTA；Kcnq1ot1-Mus-31978-R：AGCTT AAAAACCTGGAGACTTGCCCTATTTCTCTTGAA AATAGGGCAAGTCTCCAGGGGG；Kcnq1ot1-Mus-45566-F：GATCCCCGCTGCTCACTTAGT AACTATT CAAGAGATAGTTACTAAGTGAGCAGCTTTTTA；Kcnq1ot1-Mus-45566-R：AGCTTAAAAAGCTGCTC ACTTAGTAACTATCTCTTGAATAGTTACTAAGTG AGCAGCGGG。梯度退火得到雙鏈shRNA序列；并連接到經(jīng)BglⅡ和HindⅢ雙酶切的線性pSuper載體上；隨后EcoRⅠ酶切pSUPER-shRNAs、T4聚合酶補(bǔ)缺口、XhoⅠ酶切后的產(chǎn)物連接到經(jīng)EcoRV和XhoⅠ雙酶切的線性慢病毒載體pCCL.PPT.hPGK.GFP.Wpre。經(jīng)測序確證得到正確的Kcnq1ot1-shRNAs和對照shRNA。

1.2.6 熒光實時定量PCR TRIzol法抽提細(xì)胞總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，熒光實時定量PCR采用TAKARA染料說明指導(dǎo)，運(yùn)用LightCycler儀器檢測基因表達(dá)的情況。引物序列為：mGapdh-F：ACCCAGAAGACTGTGGATGG；mGapdh-R：TTCA GCTCAGGGATGACCTT；mKcnq1ot1-F：GGTCTGA GGTAGGGATCAGG；mKcnq1ot1-R：GGCACACGG TATGAGAAAAGATTG；mRunx2-F：GGGGCAGTC ATAACTGGGTT；mRunx2-R：GCGTGGGAACAGG TCACTTA；mAlp-F：ACACCTTGACTGTGGTTACT GCTGA；mAlp-R：CCTTGTAGCCAGGCCCGTTA；mNeat1-F:GGGAAGGGTGTGGTCAGAAG；mNeat1-R：GGCAGGTTGGCTCCTACAAT；mBsp-F：CCGGC CA CGCTACTTTCTT；mBsp-R：GGACTGGAAACC GTTTC；mBglap-F：CAGACAAGTCCCACACAGCA；mBglap-R：CTTGGCATCTGTGAGGTCAG；mCtsk-F：GAAGAAGACTCACCAGAAGCAG；mCtsk-R：TCC AGGTTATGGGCAGAGATT；mOscar1-F：TGGCGGT TTGCACTCTTCA；mOscar1-R：GATCCGTTACCAG CAGTTCCAGA；mNfatc1-F：CTCGAAAGACAGCA CTGGAGCAT；mNfatc1-R：CGGCTGCCTTCCGTCT CATAG。

1.2.7 核漿分離提取RNA 按照life invitrogen公司PARISTMKit（貨號AM1921）說明書分別提取MC3T3-E1和RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿RNA；隨后逆轉(zhuǎn)錄、熒光實時定量PCR檢測Kcnq1ot1亞細(xì)胞定位。

1.2.8 TRAP染色 將RAW264.7或BMMs鋪于24孔板中，用100 ng/mLRANKL聯(lián)合M-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)至顯微鏡下可見融合（一般6～8 d）后進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶染色。染色時，首先移除培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，每次3 min。4%的多聚甲醛固定10 min，PBS洗3遍，每次3 min。0.1% Triton-100通透30 min，PBS洗3遍，每次3 min。PBST孵育10min后，按照24孔板每孔400～500 μL加入新鮮配制的TRAP染液，37℃烘箱反應(yīng)1 h。每孔加入100μLPBS進(jìn)行拍照。

1.2.9 ALP染色 將MC3T3-E1細(xì)胞鋪于96孔板中，用50 μg/mL抗壞血酸，10 mmol/mL β-甘油磷酸酯和10-7mmol/mL地塞米松（1次/2 d換液）誘導(dǎo)7 d后用4%多聚甲醛4℃固定30 min，PBS洗3遍，每次3 min；加入BCIP/NBT染液室溫避光孵育30 min，隨后用蒸餾水洗3遍，每次3min；每孔加入50μLPBS進(jìn)行拍照。

1.2.10 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究實驗均獨立重復(fù)3次，實驗中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢去勢（OVX）小鼠骨質(zhì)疏松模型中l(wèi)nc-Kcnq1ot1的表達(dá)

與對照組相比，OVX小鼠股骨組織中破骨相關(guān)基因Nfatc1表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），而成骨相關(guān)基因Bglap、Runx2以及l(fā)nc-Kcnq1ot1表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1A）。

2.2 鼠尾懸吊（TS）小骨質(zhì)疏松模型中l(wèi)nc-Kcnq1ot1的表達(dá)

與對照組相比，TS小鼠股骨組織中破骨相關(guān)基因Mmp9和Nfatc1表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），而成骨相關(guān)基因Bsp以及l(fā)nc-Kcnq1ot1表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1B）。

2.3 自然衰老骨質(zhì)疏松模型中l(wèi)nc-Kcnq1ot1的表達(dá)

與對照組相比，老齡小鼠股骨組織中破骨相關(guān)基因Nfatc1表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），而成骨相關(guān)基因Bglap、Runx2以及l(fā)nc-Kcnq1ot1表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1C）。

圖1 長鏈非編碼RNA Kcnq1ot1在小鼠疏松股骨組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of lnc-Kcnq1ot1 in different mouse models of osteoporosis.A:OVX and shamoperated mice(n=5).B:TS and control mice(n=5).C:8-and 18-month-old mice(n=5).The data are presented as Mean±SD from at least triplicate experiments.*P＜0.05vsSham or 8 months.

2.4 MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化過程中l(wèi)nc-Kcnq1ot1的表達(dá)變化

與未誘導(dǎo)組相比，成骨誘導(dǎo)后Bglap、Alp和lnc-Kcnq1ot1的表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 長鏈非編碼RNA Kcnq1ot1在MC3T3-E1細(xì)胞向成骨分化過程中的表達(dá)Fig.2 Expression of lnc-Kcnq1ot1 during osteoblast differentiation of MC3T3-E1 cells.The data are presented as Mean±SD from at least triplicate experiments.*P＜0.05 vs0d.

2.5 BMMs破骨分化過程中l(wèi)nc-Kcnq1ot1的表達(dá)變化

與未誘導(dǎo)組相比，破骨誘導(dǎo)后破骨相關(guān)基因Ctsk和Oscar表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖3A），而lnc-Kcnq1ot1的表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3B）。

2.6 RAW264.7細(xì)胞破骨分化過程中l(wèi)nc-Kcnq1ot1的表達(dá)變化

與未誘導(dǎo)組相比，破骨誘導(dǎo)后破骨相關(guān)基因Ctsk和Oscar表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖3C），而lnc-Kcnq1ot1的表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3D）。

圖3 長鏈非編碼RNA Kcnq1ot1在破骨細(xì)胞分化過程中的表達(dá)Fig.3 Expression of lnc-Kcnq1ot1 during osteoclast differentiation of BMMs and RAW264.7cells.The data are presented as Mean±SD from at least triplicate experiments.*P＜0.05vs0d.

2.7 沉默lnc-Kcnq1ot1對成骨分化的影響

與shRNA-NC組相比，lnc-Kcnq1ot1-shRNAs組細(xì)胞中l(wèi)nc-Kcnq1ot1表達(dá)顯著降低，且成骨相關(guān)基因Alp和Bglap的表達(dá)同樣顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4A～C）。與NC+成骨誘導(dǎo)7d組相比，lnc-Kcnq1ot1-shRNAs+成骨誘導(dǎo)7 d組細(xì)胞中l(wèi)nc-Kcnq1ot1表達(dá)顯著降低，且成骨相關(guān)基因Alp和Bglap的表達(dá)同樣顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4A～C）。ALP染色結(jié)果進(jìn)一步證實沉默lnc-Kcnq1ot1抑制成骨誘導(dǎo)劑引起的成骨細(xì)胞分化（圖4D）。

圖4 沉默lnc-Kcnq1ot1對成骨細(xì)胞分化的影響Fig.4 Knockdown of lnc-Kcnq1ot1 inhibits osteoblast differentiation.MC3T3-E1 cells were infected with lentivirus-mediated sh-lnc-Kcnq1ot1 or sh-control,and subsequently stimulated with osteogenic differentiation medium for 7 days.The RNA levels of lnc-Kcnq1ot1(A),Alp(B)and Bglap(C)were determined by qRT-PCR.D:Representative images of ALP staining.The data are presented asMean±SD from at least triplicate experiments.*P＜0.05vsshRNA-Ctrl;#P＜0.05vsshRNA-Ctrl+7d.

2.8 沉默lnc-Kcnq1ot1對BMMs破骨分化的影響

與si-NC組相比，lnc-Kcnq1ot1-siRNAs組細(xì)胞中l(wèi)nc-Kcnq1ot1表達(dá)顯著降低，而破骨相關(guān)基因Ctsk和Oscar的表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5A～C）。與NC+破骨誘導(dǎo)8 d組相比，lnc-Kcnq1ot1-siRNAs+破骨誘導(dǎo)8 d組細(xì)胞中l(wèi)nc-Kcnq1ot1表達(dá)顯著降低，而破骨相關(guān)基因Ctsk和Oscar的表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5A～C）。誘導(dǎo)8 d后進(jìn)行TRAP染色，結(jié)果進(jìn)一步證實沉默lnc-Kcnq1ot1后破骨細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)（圖5D）。

圖5 沉默lnc-Kcnq1ot1對小鼠BMMs向破骨細(xì)胞分化的影響Fig.5 Knockdown of lnc-Kcnq1ot1 promotes osteoclast differentiation of BMMs.BMMs were transfected with si-lnc-Kcnq1ot1 or si-NC every three days,and simultaneously stimulated with or without M-CSF and/or RANKL for 8 days.The expression of lnc-Kcnq1ot1(A),Ctsk(B)and Oscar(C)was determined by qRT-PCR.D:Representative images of TRAP staining(Original magnification:×100).The data are presented as Mean±SD from at least triplicate experiments.*P＜0.05vsNC;#P＜0.05vsNC+8d.

2.9 沉默lnc-Kcnq1ot1對RAW264.7破骨分化的影響

與si-NC組相比，lnc-Kcnq1ot1-siRNAs組細(xì)胞中l(wèi)nc-Kcnq1ot1表達(dá)顯著降低，而破骨相關(guān)基因Ctsk和Oscar的表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖6A～C）。與NC+破骨誘導(dǎo)4 d組相比，lnc-Kcnq1ot1-siRNAs+破骨誘導(dǎo)4 d組細(xì)胞中l(wèi)nc-Kcnq1ot1表達(dá)顯著降低，而破骨相關(guān)基因Ctsk和Oscar的表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖6A～C）。誘導(dǎo)4 d后進(jìn)行TRAP染色，結(jié)果進(jìn)一步證實沉默lnc-Kcnq1ot1后破骨細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)（圖6D）。

圖6 沉默lnc-Kcnq1ot1對RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響Fig.6 Knockdown of lnc-Kcnq1ot1 promotes osteoclast differentiation of RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were transfected with silnc-Kcnq1ot1 or si-control every two days,and simultaneously stimulated with RANKL for 4 days.The expression of lnc-Kcnq1ot1(A),Ctsk(B)and Oscar(C)was determined by qRT-PCR.D:Representative images of TRAP staining(×100).The data are presented asMean±SD from at least triplicate experiments.*P＜0.05vsNC;#P＜0.05vsNC+4d.

2.10 lnc-Kcnq1ot1的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，lnc-Kcnq1ot1主要存在于細(xì)胞核（圖7）。

圖7 核漿分離確定lnc-Kcnq1ot1亞細(xì)胞定位Fig.7 Determination of the subcellular localization of lnc-Kcnq1ot1.RNA was extracted from the nuclei or cytoplasm of MC3T3-E1(A)and RAW264.7(B)cells.The RNA level of lnc-Kcnq1ot1,Neat1(nuclear retained),and Gapdh(cytoplasm retained)was determined by qRT-PCR.The data are presented as Mean±SD from at least triplicate experiments.

3 討論

人類全基因組測序結(jié)果顯示，具有編碼蛋白質(zhì)功能的基因不到全部基因組序列的2%，而在占據(jù)人類基因組98%以上的非蛋白編碼序列中，絕大多數(shù)被轉(zhuǎn)錄成長度大于200個堿基的lncRNAs［5］。近年來針對lncRNAs的功能研究表明，一方面lncRNAs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、心臟發(fā)育以及骨骼肌發(fā)育等生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［18,24-27］；另一方面，lncRNAs的異常表達(dá)與多種人類疾病密切相關(guān)，例如阿爾茨海默病、心血管疾病、肝纖維化和癌癥等［7-9,12,17-18,28］。lnc-Kcnq1ot1與H3K9和H3K27特異性組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a和PRC2結(jié)合，進(jìn)而沉默位于同一印記基因簇的其他基因［15］。lnc-Kcnq1ot1通過調(diào)節(jié)miR-129-5p及JAG1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲［11］。lnc-Kcnq1ot1通過miR506-3p促進(jìn)氧化應(yīng)激、細(xì)胞焦亡和炎癥，進(jìn)而促進(jìn)糖尿病腎病進(jìn)展［21］。最新研究表明，lnc-Kcnq1ot1通過miR-221促進(jìn)IκB表達(dá)，進(jìn)而抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖、炎癥及內(nèi)膜增生［20］。lnc-Kcnq1ot1還被報道參與骨肉瘤的進(jìn)展以及促進(jìn)骨折愈合［29-30］。然而，lnc-Kcnq1ot1在骨質(zhì)疏松癥以及破骨細(xì)胞分化過程中的作用仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)lnc-Kcnq1ot1在OVX致小鼠的疏松骨組織中、鼠尾懸吊致小鼠疏松骨組織中、自然衰老致小鼠疏松骨組織中以及BMMs、RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)量顯著降低，而在MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化過程中表達(dá)量顯著上調(diào)，提示lnc-Kcnq1ot1參與成骨與破骨分化的調(diào)節(jié)。在本研究中，我們以慢病毒為載體在MC3T3-E1細(xì)胞中沉默lnc-Kcnq1ot1后可顯著下調(diào)Alp和Bglap的表達(dá)，并抑制成骨誘導(dǎo)劑引起的這些基因的上調(diào)。ALP染色結(jié)果同樣證實沉默lnc-Kcnq1ot1抑制成骨誘導(dǎo)劑引起的成骨細(xì)胞分化，這部分的結(jié)果與其他課題組報道的lnc-KCNQ1OT1促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的結(jié)論相一致［22-23,31］。我們進(jìn)一步運(yùn)用小干擾RNAs在BMMs和RAW264.7細(xì)胞中沉默lnc-Kcnq1ot1的表達(dá)，隨后向破骨方向誘導(dǎo)。熒光實時定量PCR結(jié)果首次證實沉默lnc-Kcnq1ot1促進(jìn)破骨相關(guān)基因Ctsk和Oscar的表達(dá)；TRAP染色結(jié)果進(jìn)一步確證下調(diào)lnc-Kcnq1ot1顯著促進(jìn)破骨分化，以上的結(jié)果為lnc-Kcnq1ot1成為治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

lncRNAs可與蛋白質(zhì)、DNA和RNA相互作用，實現(xiàn)其在不同多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)水平，例如在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。而lncRNAs的細(xì)胞定位決定著其發(fā)揮作用的途徑和機(jī)制［5］。在細(xì)胞漿內(nèi)，lncRNAs主要通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。目前的研究表明lncRNAs主要可以通過增加mRNA的穩(wěn)定性、降低mRNA的穩(wěn)定性、促進(jìn)mRNA的翻譯、抑制mRNA的翻譯、作為microRNA的前體調(diào)節(jié)基因、ceRNA這6種機(jī)制起作用。而在細(xì)胞核內(nèi)，lncRNAs主要通過各種機(jī)制調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，并且lncRNAs還參與細(xì)胞核內(nèi)各種亞核結(jié)構(gòu)的構(gòu)建［5］。盡管近年來很多文獻(xiàn)報道lnc-Kcnq1ot1可以通過ceRNA機(jī)制，吸附不同的miRNAs調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而參與多種疾病的進(jìn)展［17-18,22-23］。然而，在本研究中，我們通過核漿分離提取細(xì)胞核和細(xì)胞漿中RNA，并用實時熒光定量PCR技術(shù)證實lnc-Kcnq1ot1主要存在于細(xì)胞核，這也與最初報道的lnc-Kcnq1ot1是一個細(xì)胞核內(nèi)較穩(wěn)定的長鏈非編碼RNA一致［15］，同時也提示我們在后續(xù)的機(jī)制研究中需要關(guān)注其亞細(xì)胞定位。

綜上所述，長鏈非編碼RNA Kcnq1ot1促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和抑制破骨細(xì)胞分化，為臨床骨質(zhì)疏松癥的治療提供了新靶點。