金童,陳鋮

武漢大學人民醫(yī)院腎內科, 武漢 430060

據國際糖尿病聯(lián)盟最新報告統(tǒng)計，2019年全球約4.63億成人(20～79歲)患糖尿病，約有420萬人(20～79歲)死于糖尿病或其并發(fā)癥。預計到2030年和2045年糖尿病患者將分別達到5.784億和7.002億[1]。糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，在過去的十年中DN的發(fā)病率不斷上升，是全球終末期腎臟疾病(ESRD)的主要原因之一[2]。因此，研究DN的發(fā)病機制和相應的治療措施十分重要。當前已明確糖尿病腎病的發(fā)病機制與糖代謝異常、脂代謝紊亂、免疫炎癥、氧化應激、內質網應激、凋亡自噬等因素相關[3]。其中內質網應激(ERS)在DN的發(fā)生和進展中起著關鍵的作用，具有很重要的研究前景。ERS通過觸發(fā)細胞的3條經典的未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)信號通路來促進ER處理應激的能力，本質上是一種機體對有害刺激的自身應答反應，然而過強或持續(xù)的ERS超越了細胞的耐受能力，將會導致細胞凋亡。本文就DN中ERS激活UPR的調控機制以及二者關系的研究進展進行綜述，以期為DN的治療研究提供參考。

1 內質網應激和未折疊蛋白反應

1.1 內質網穩(wěn)態(tài)及維持

內質網是多功能的膜性細胞器，負責真核細胞中至少三分之一的蛋白質合成、折疊、組裝和運輸，通過監(jiān)測所有進入細胞器的蛋白質的生物合成、折疊、組裝、運輸和降解的過程來調節(jié)蛋白質穩(wěn)態(tài)，其穩(wěn)態(tài)的平衡對于細胞的正常生理功能極其重要[3-4]；同時內質網也是細胞內鈣離子穩(wěn)態(tài)調節(jié)及多種脂質(類固醇和膽固醇)合成的重要場所。內質網中一些分子伴侶和酶對于正確的蛋白折疊和內質網正常生物合成至關重要[5]。

內質網穩(wěn)態(tài)參與多種生理和病理過程，當各種刺激因素如營養(yǎng)缺乏、缺血缺氧、感染、氧化應激、內質網鈣含量異常、脂質超載等導致內質網穩(wěn)態(tài)失衡時，就會發(fā)生內質網應激反應，可激活未折疊蛋白反應、內質網超負荷反應和固醇調節(jié)級聯(lián)反應等信號通路[6-8]。其中 UPR是目前研究最多的通路，可通過調節(jié)基因表達程序來提升內質網的應激處理能力，包括以下幾個方面：①抑制蛋白質合成以預防細胞被自身合成的錯誤蛋白質所侵害；②分泌特定的蛋白酶降解錯誤折疊的蛋白質；③誘導分子伴侶和蛋白質加工酶基因的表達來增強蛋白質的折疊能力；④增加參與脂質代謝基因的表達來促進ER膜擴張，從而增強ER的功能[7-9]。簡單來說，這個反應就是細胞對于蛋白質的一個質量控制系統(tǒng)，用來修復/銷毀被錯誤折疊的蛋白質，最終目的是減輕內質網負擔與重建內質網穩(wěn)態(tài)。研究表明適宜的刺激可激活UPR啟動細胞保護機制以維持內質網穩(wěn)態(tài)，在無法補救的ERS情況下，UPR會轉變?yōu)榱硪粋€信號平臺，稱為末端UPR，過強或長時間刺激可引發(fā)過度UPR激活細胞損傷機制致細胞凋亡，進而導致疾病的發(fā)生和進展[10]。

1.2 UPR與內質網應激

哺乳動物中，UPR由分子伴侶葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)/免疫球蛋白結合蛋白(BIP)及3種內質網跨膜蛋白所介導，后者分別是：肌醇需求酶1 (inositol-requiring enzyme, IRE1)、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶(double stranded RNA-dependent protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和活化轉錄因子6 (activating transcription factor 6, ATF6)[6]。正常情況下，GRP78與上述3種蛋白的腔結構域結合，處于失活狀態(tài)，當發(fā)生ERS時，3種酶與BIP解離后被活化，分別激活下游生存信號通路。然而ERS是一把雙刃劍，當細胞處于過度或持續(xù)的ERS下，促凋亡轉錄因子如CHOP、c-JNK、Capase-12被激活，細胞的凋亡程序啟動[11-12]。

1.2.1IRE-1信號通路 IRE-1是位于內質網膜上的Ⅰ型跨膜蛋白, 具有核酸內切酶活性的胞質段結構域，介導最保守的一條UPR信號通路[13]。ERS發(fā)生時，IRE-1與GRP78解離，與錯誤折疊蛋白結合，其N端發(fā)生二聚化并觸發(fā)了自身的磷酸化，C端的核酸內切酶活性被變構激活，活化后的IRE-1與XBP1(X box binding protein-1) 前體mRNA結合，剪切26個堿基內含子組成的片段產生新的mRNA，翻譯成活躍且穩(wěn)定的轉錄因子XBP1s(X box binding protein 1 splicing)[7,14]。XBP1s和ERS反應元件結合誘導激活內質網相關性降解因子(endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD)和內質網分子伴侶蛋白的表達，從而促進細胞的適應性生存[15]。

1.2.2PEPK信號通路 PERK與IRE-1也是位于內質網膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，含有腔內應激感應結構域和胞質內絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能域[16]。發(fā)生ERS時，游離的PERK發(fā)生激酶結構域的同源二聚化和自身磷酸化而激活，通過使真核翻譯起始因子2α(eIF2)51位的絲氨酸磷酸化, 減慢了整體蛋白質的翻譯速度，使細胞有更多的時間折疊積壓在ER內腔中的蛋白質[17]，這種翻譯抑制作用對于維持胰腺β細胞存活和代謝穩(wěn)態(tài)至關重要[18]。此外, 磷酸化的eIF2α能夠激活活化轉錄因子4(ATF4)的翻譯, 從而上調許多UPR目標基因的翻譯水平以增強內質網的蛋白折疊能力、抗氧化反應和自噬能力[19]。

1.2.3ATF6通路 ATF6是一種Ⅱ型ER跨膜蛋白，包括腔內C末端、跨膜區(qū)、胞質N末端3個結構域。在胞質中包含bZIP轉錄激活域，在ER內腔中包含壓力感應結構域[13]。發(fā)生ERS時，ATF6與GRP78解離后被轉運到高爾基體，由高爾基體蛋白酶S1P及S2P對其跨膜片段進行切割,產生游離的50 kD大小的N端片段，轉移到細胞核后結合內質網應激反應元件(ERSE)上調GRP78、GRP94和Calreticulin等分子伴侶和XBP1基因的表達[20-21]。此外，ATF6可通過與XBP1s形成異源二聚體上調內質網相關的蛋白質降解因子、分子伴侶、糖基化酶，細胞內轉運機制和蛋白質二硫鍵異構酶來增強ER蛋白的折疊能力的表達，緩解ERS的壓力[22-23]。

1.3 UPR介導的凋亡途徑

細胞凋亡有3條途徑：線粒體/細胞色素c介導的凋亡途徑、死亡受體介導的凋亡途徑和ERS誘導性凋亡途徑[19]。近年來，誘導性途徑ERS逐漸受到關注，主要有3條信號通路參與(圖1)：①CHOP/GADD153信號通路：持續(xù)活化的PERK通過促進ATF4 mRNA的轉錄表達，上調CHOP基因，并通過ROS產生和ATP消耗促進細胞凋亡[24]。過表達的CHOP可以下調抗凋亡基因Bcl-2的表達，加速細胞凋亡。同時，CHOP可激活GADD34，促進磷酸化真核翻譯起始因子2α亞基(p-eIF2α)去磷酸化，形成PERK通路的負反饋調節(jié)，使蛋白合成暫停得以恢復[25]。此外，有研究指出，CHOP可下調抗凋亡蛋白BCL2、BCL-XL和MCL-1的表達，并上調BIM的表達，從而促進BAK和BAX的表達。BAX-BAK發(fā)生寡聚化后，寡聚體通過線粒體透化作用導致凋亡因子如細胞色素c(Cyt c)和凋亡誘導因子(AIF)釋放，最終導致細胞死亡。②JNK信號通路：活化的IRE-1α與TRAF2結合后激活ASK1，三者形成復合物后進一步激活JNK，上調CHOP、Bcl-2 家族中的促凋亡因子PUMA、BID和BIM，同時下調抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL，引發(fā)線粒體途徑介導的細胞凋亡。同時IRE1α-TRAF2也能通過鈣調蛋白分解酶活化Caspase-12，激活Caspase介導的凋亡通路[26-27]。③Caspase-12信號通路：Caspase激活是一個級聯(lián)放大反應，ERS時，內質網釋放Ca2+進入細胞質中，刺激周圍鈣蛋白酶(Calpain)的活化并轉移到內質網外膜，同時引發(fā)Caspase-7轉位后活化，兩者均可將Procaspase-12水解為活化的Caspase-12進入胞漿發(fā)揮作用，并可通過細胞色素c非依賴途徑激活Caspase-9、Caspase-3等，引發(fā)細胞凋亡[28]。

2 ERS參與DN發(fā)生發(fā)展的機制研究

DN的臨床表現(xiàn)主要是蛋白尿、水腫、腎功能減退，形態(tài)學表現(xiàn)為腎小球細胞外基質堆積、系膜擴張、基底膜增厚、足突融合、腎小球硬化及腎小管間質纖維化。ERS與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關，研究證明DN的很多屬性，如高血糖癥、蛋白尿、晚期糖基化終產物和游離脂肪酸的增加，都可

圖1 UPR介導的細胞適應性途徑和凋亡途徑Fig.1 UPR mediated adaptive and apoptotic pathways of cells

以觸發(fā)腎細胞中的未折疊蛋白反應。在1型糖尿病的鏈脲佐菌素模型中，腎小球和腎小管細胞中BIP、p-PERK、p-JNK、CHOP/GADD153和Caspase-12的水平升高有關。在2型糖尿病腎病的db/db小鼠模型中，內質網應激通過XBP1s觸發(fā)了炎癥基因的表達。下面介紹ERS在不同腎細胞類型中的相關研究。

2.1 參與腎小球足細胞損傷

足細胞是終末分化的腎小球上皮細胞，再生能力有限。據報道，蛋白尿是DN腎小球功能障礙的原因，ERS是白蛋白引起足細胞損傷的重要機制之一。Goncalves等[29]研究表明GRP78/IRE1-α/PKC-δ/Caspase-12信號通路參與了ERS和誘導白蛋白超負荷依賴性足細胞損傷和凋亡。CHOP是導致凋亡激活的關鍵ERS轉錄因子,Fan等[30]研究發(fā)現(xiàn),網狀蛋白1A(RTN1A)誘導PERK磷酸化從而誘導CHOP表達,CHOP的敲低顯著抑制了RTN1A的表達，RTN1A和CHOP之間的正反饋回路導致足細胞ERS增強，RTN1A可能是足細胞ERS的關鍵調節(jié)因子。長基因間非編碼RNA(LINC01619)在腎臟中主要分布在足細胞細胞質，通過充當miR-27a的“海綿”發(fā)揮生物學功能。高糖培養(yǎng)的足細胞中，LINC01619表達下調，對miR-27a的吸附減少，負向調控叉頭盒蛋白O1(FOXO1)激活ERS介導的凋亡途徑并導致足細胞損傷，因此LINC01619可作為競爭性內源RNA調節(jié)DN中miR-27a/FOXO1介導的內質網應激和足細胞損傷[31]。

2.2 參與腎小球系膜細胞(GMCs)損傷

腎小球系膜細胞是DN進展的重要標志。在高糖刺激腎小球系膜細胞內，miR-148b、GRP78、CHOP表達均顯著上調，靶向抑制AMPKα1的表達，從而誘導ERS介導的凋亡途徑，使腎小球系膜細胞產生過多細胞外基質蛋白[32]。脂毒性是DN惡化的主要原因之一，可通過PERK和ATF6信號通路誘導腎小球系膜細胞凋亡。Park等[33]研究表明,蛋白質精氨酸甲基轉移酶1(PRMT1)介導模擬細胞脂毒性的棕櫚酸酯誘導的ERS凋亡途徑致腎小球系膜細胞凋亡，降低PRMT1表達或降低其酶活性的策略可用于預防糖尿病性腎病的惡化。此外，研究表明脂肪酸結合蛋白4(FABP4)主要在人腎活檢的腎小球系膜細胞中表達，在DN中，F(xiàn)ABP4的表達上調伴隨著GRP78和Caspase-12的上調，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達下調，導致系膜細胞凋亡[34]。

2.3 參與腎小球內皮細胞(GECs)損傷

高糖誘導的ERS與糖尿病患者內皮細胞功能障礙的各個方面密切相關。GECs損傷是糖尿病的主要事件，導致多種大血管和微血管并發(fā)癥。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)可以拮抗Ang 1與Tie2受體結合，血管生成素1(Angpt1)顯著降低了AngⅡ誘導的ERS反應蛋白GRP78、GRP94、p-PERK和CHOP的表達[35]。此外，Angpt1通過GECs中的Tie2受體/ERK1/2-p38 MAPK途徑減輕了ERS誘導的細胞損傷和凋亡[36]。

2.4 參與腎小管上皮細胞(TECs) 損傷

腎小管上皮細胞暴露于高濃度人血清白蛋白后可呈時間、劑量依賴性上調GRP78的表達，激活PERK-CHOP凋亡通路，細胞凋亡也呈進行性增加。蛋白尿會促進糖尿病腎病的發(fā)展，并誘發(fā)ERS和腎上皮小管細胞上皮-間質轉化(EMT)[37]。在DN患者腎活檢的腎小管間質中UPR相關基因顯著上調，DN的腎損傷伴隨著Caspase-12活化和腎小管細胞凋亡[38]。在高葡萄糖處理的腎小管上皮細胞中，ATF6的抑制而非PERK的抑制會阻止PRMT1誘導的EMT。此外，Pang等[39]發(fā)現(xiàn)尿激肽原Ⅱ(UrotensinⅡ)可能通過觸發(fā)ERS途徑，上調GRP78、CHOP的表達誘導腎小管上皮細胞EMT并增加細胞外基質的生成。

3 通過調控ERS治療DN的研究進展

近年來，研究者們在ERS途徑的調控方面展開了大量的研究，針對ERS的靶點進行干預治療DN或成為具有潛力的新方法(圖2)。被稱為“人工合成分子伴侶”的小分子化合物如4-苯基丁酸(4-PBA)和?；撬嵝苋パ跄懰?TUDCA)是經典的ERS抑制劑，可通過阻斷ERS介導的凋亡途徑PERK-eIF2α-CHOP通路來預防AGEs誘導的足細胞凋亡。有研究證實在用TUDCA處理的db/db-Unx小鼠中，RTN1A以及GRP78、p-PERK和CHOP的表達在蛋白質和mRNA水平上均受到抑制，這表明TUDCA在DN中通過抑制足細胞中的RTN1A和ERS而發(fā)揮保護作用。Cao等[40]研究發(fā)現(xiàn)TUDCA和4-PBA均可下調ERS相關蛋白BiP、p-PERK、p-IRE1α、ATF-6、XBP-1、Caspase-12和Caspase-3的表達，從而在體外抑制UPR，恢復葡萄糖耐量和改善胰島素敏感性，逆轉腎小球系膜擴張，減少蛋白尿，調節(jié)自噬體數量來預防DN的發(fā)展。使用TUDCA進行治療，還可以減輕腎小管間質纖維化，改善糖尿病腎病，包括尿白蛋白和肌酐比值和尿白蛋白排泄率，并減少TECs的凋亡[41]。Fang等[42]研究表明在腎小球系膜細胞中，F(xiàn)ABP4抑制劑BMS309403通過FABP4減弱了ERS標志物GRP78、CHOP、Caspase-12的誘導從而減輕了細胞凋亡。依達拉奉是一種有效的自由基抑制劑，在臨床上作為腦保護劑，可通過p-eIF2α和CHOP抑制作用來防止脂質過氧化和ERS引起的缺氧，在防治DN方面的作用值得進一步研究[43]。最近，Chu等[44]發(fā)現(xiàn)阿司匹林可能通過部分阻斷PERK通路，從而抑制高脂血癥誘導的足細胞ERS。此外，二甲雙胍可以通過激活單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)途徑，減弱高糖誘導的腎小管上皮細胞內質網應激和腎纖維化[45]。我國的一些傳統(tǒng)中醫(yī)藥也可通過干預ERS靶點來預防腎臟損害，例如，番紅花和槲皮素通過抑制ROS介導的ERS途徑來預防細胞凋亡[44]；黃芪甲苷 IV(AS-IV)可能通過下調p-PERK、ATF4和CHOP的表達來抑制內質網應激誘導的足細胞凋亡[45]；大黃素通過抑制PERK-eIF2α信號傳導通路來減輕足細胞的凋亡[44]。要確定這些藥物在多大程度上可以緩解腎臟ERS減少腎臟損傷，仍需要進一步的評估研究。

圖2 靶向內質網應激治療糖尿病腎病的分子機制Fig.2 Molecular mechanism of targeting endoplasmic reticulum in emergency treatment of diabetic nephropathy

4 展望

ERS/UPR對于細胞生命活動的調節(jié)是一把雙刃劍，對于細胞來說既是一種反應性保護機制，又可以啟動凋亡程序，所以調控兩者之間的平衡并充分發(fā)揮保護作用仍是需要不斷研究的方向。同時，由于很多作用于ERS的藥物缺乏特異性、安全性和有效性，因此需要加強開發(fā)和評估針對ERS途徑的特定分子的無毒性藥。DN中的多種因素諸如氧化應激、自噬等可導致ERS激活，最新有文獻報道鐵死亡、炎癥小體等機制也可能與ERS偶聯(lián)，深入探究ERS與其他作用機制特定效應分子、信號通路的相關性，將為以后的臨床治療和預防提供新思路。