陳桂德,齊 林,戎雪冰

(1.河北省保定市第一醫(yī)院，河北 保定 071000 2、河北省承德醫(yī)學院研究生院，河北 承德 067000)

肺癌是世界上常見的惡性腫瘤且是癌癥相關(guān)性死亡的重要因素。肺癌中約80～85%是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。盡管NSCLC的治療藥物和策略已經(jīng)取得了很大的進展，但是NSCLC患者的五年總生存率仍然很低，這與其發(fā)現(xiàn)晚和早期轉(zhuǎn)移有關(guān)。目前影像學檢查很難精確的區(qū)分肺的良惡性病變。支氣管檢查活檢和經(jīng)皮穿刺雖然可獲取病理組織增加了確診率，但是有一定的適應(yīng)癥和導致呼吸困難、氣胸、血胸和腫瘤出血等風險，費用高，增加了患者的痛苦和經(jīng)濟負擔，限制了其應(yīng)用。因此，找到高效的生物學標志物和治療靶標對NSCLC的診斷治療和預后有著重要的意義。近年來，環(huán)狀RNA(circRNA)因其在惡性腫瘤形成和發(fā)展中的關(guān)鍵作用得到越來越多的關(guān)注。其在真核細胞中廣泛表達，是一類單鏈RNA分子的內(nèi)源性非編碼RNA，參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控。CircRNA是共價連接形成的封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不具有5'帽和3'poly(A)尾巴。通過將上游3'剪接受體與下游5'剪供體連接起來而形成“反向拼接”結(jié)構(gòu)。這種獨特的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其能夠耐受核酸外切酶，比線性RNA同工型更加穩(wěn)定，半衰期更長。越來越多研究證實circRNA通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡和侵襲等病理生理過程在腫瘤演變和進展的生物學過程中扮演著重要角色。研究顯示，hsa-circRNA-103809通過miR-532-3p/FOXO4軸調(diào)控直腸癌的細胞增殖和遷移[1]。有研究證明，circAGFG1充當miR-195-5p海綿，通過調(diào)節(jié)CCNE1以促進三陰性乳腺癌進展[2]。有報道hsa-circRNA-101996通過抑制miR-8075激活TPX2表達來增加子宮頸癌的增殖和侵襲[3]。CircHIPK3在膀胱癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、慢性粒細胞白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中高表達，與腫瘤增殖、侵襲和預后等相關(guān)[4,5]。而circHIPK3與NSCLC患者診療及預后的關(guān)系未見文獻報道。在這項研究中，首先通過qRT-PCR確定了NSCLC手術(shù)切除的腫瘤組織和腫瘤旁正常組織及腫瘤患者血漿和健康體檢者血漿中circHIPK3的表達水平，并評估了其臨床病理學意義。受試者工作(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線判斷circHIPK3的敏感性和特異性，進一步研究circHIPK3與NSCLC患者生存率及預后的關(guān)系，從而判定circHIPK3可能是NSCLC的潛在生物標志物和治療靶標。

1 材料與方法

1.1研究對象和臨床標本收集：54例NSCLC組織和與之匹配的相鄰正常肺組織樣本(距腫瘤邊緣≥3cm)是從2013年6月至2015年1月在保定市第一醫(yī)院進行手術(shù)的NSCLC患者中收集的。手術(shù)標本立即保存在液氮中直至使用。收集以上患者及健康體檢者的空腹外周靜脈血靜54例(兩組年齡、性別和身體質(zhì)量指數(shù)相匹配)，離心后保存至液氮中備用。所有患者均具有NSCLC的病理組織學診斷。所有參與本研究的人員都簽署了知情同意書，并且獲得保定市第一醫(yī)院道德倫理委員會的批準。所有患者術(shù)前均未行化放療并定期電話或到家隨訪。本研究遵守《赫爾辛基宣言》。依據(jù)世界衛(wèi)生組織的TNM分期分類系統(tǒng)確定所有收集標本的臨床分期。

1.2總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄，實時定量PCR:使用Trizol(Invitrogen)從組織樣品中提取總RNA。RNA濃度和純度使用NanoDrop ND-1000分光光度計(NanoDrop Technologies)進行測量。使用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa，中國大連)合成cDNA。實時PCR分析是使用SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Life Technologies)和ABI 7500實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)。內(nèi)參為GAPDH，每個樣本3個復孔，至少3次獨立的試驗。circHIPK3表達比較使用ΔCt方法。Sangon Biotech (上海, 中國)合成引物序列(見表1)。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1circHIPK3在NSCLC癌組織和癌旁正常組織中的表達:在NSCLC中，circHIPK3表達水平在癌組織較癌旁正常肺組織表達顯著增加(P<0.001)，見圖1。

圖1 circHIPK3在NSCLC癌組織、癌旁正常肺組織中的表達(P<0.001)，較高的ΔCt值表示較低的circHIPK3表達。

2.2circHIPK3在NSCLC患者血漿和正常體檢者血漿中的表達：circHIPK3在NSCLC患者血漿較正常體檢者血漿表達顯著增加(P<0.001)，見圖2。

圖2 circHIPK3在NSCLC患者血漿、正常體檢者血漿中的表達

2.3circHIPK3與NSCLC臨床病理特征之間的關(guān)系:NSCLC癌組織中circHIPK3表達較對照組顯著增高，進一步分析癌組織circHIPK3表達和臨床病理特征的關(guān)系。在NSCLC組織中，circHIPK3與患者腫瘤組織分化、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著差異(P<0.05)，而與年齡、性別、病理分型無顯著差異(P>0.05)(表2)。組織分化差、臨床分期晚和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者circHIPK3表達高。

表2 非小細胞肺癌circHIPK3的表達和臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4circHIPK3在NSCLC臨床診斷中的潛在價值:通過ROC曲線評估其作為生物學診斷指標的潛在價值。ROC曲線面積越大，其診斷價值越大。

2.4.1NSCLC癌組織中circHIPK3表達水平的ROC曲線:ROC曲線下面積為0.890(95%置信區(qū)間：0.826～0.953，P<0.001)。約登指數(shù)的最大值約為0.648，靈敏度=90.3%，特異度=68.5%，見圖3。

2.4.2NSCLC患者血漿中circHIPK3表達水平的ROC曲線：ROC曲線下面積為0.829(95%置信區(qū)間：0.889～0.948，P<0.001)。約登指數(shù)的最大值約為0.611，靈敏度=79.6%，特異度=83.3%，見圖4。

2.5circHIPK3表達與NSCLC患者預后的關(guān)系：依據(jù)NSCLC組織circHIPK3相對表達量中位數(shù)4.637，將患者分為circHIPK3高表達組32例和低表達組22例。兩組均隨訪5年，死亡23例，其中低表達組6例，高表達組17例。運用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗分析circHIPK3表達與NSCLC患者術(shù)后5年存活率的關(guān)系，circHIPK3高表達和低表達患者5年累積生存率分別為46.9%、72.7%，circHIPK3陽性表達患者術(shù)后生存時間較陰性患者明顯縮短(χ2=3.657，P=0.026),差別有統(tǒng)計學意義，見圖5。

2.6NSCLC患者預后的Cox比例風險回歸模型的多因素分析：Cox多因素回歸分析表明，circHIPK3、組織分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響NSCLC預后的獨立危險因素，見表3。

表3 Cox比例風險回歸模型的多因素分析

圖3 NSCLC癌組織circHIPK3表達水平的ROC曲線

圖4 NSCLC血漿circHIPK3表達水平的ROC曲線

圖5 circHIPK3高表達和低表達患者的生存曲線

3 討 論

NSCLC的治療近來快速發(fā)展，但總體治療效果不佳。尋找新的分子生物標志物和治療靶標對NSCLC的診療具有重要的現(xiàn)實意義。

CircRNA根據(jù)所包含序列的不同，分為內(nèi)含子CircRNA、外顯子CircRNA、外顯子-內(nèi)含子CircRNA三類。CircRNA最初被認為是異常剪接無功能的副產(chǎn)物，然而隨著分子生物學技術(shù)發(fā)展和研究的深入，越來越多證據(jù)揭示CircRNA在腫瘤的形成和進展中起到了重要的作用。CircRNA通過發(fā)揮miRNA的海綿樣作用、circRNA-蛋白質(zhì)作用等機制發(fā)揮作用。

CircRNA在生物的病理和生理調(diào)控過程中扮演者重要角色。包括癌癥在內(nèi)的多種疾病中circRNA表達異常。CircRNA異常表達與各種癌癥的惡性行為相關(guān)。有研究表明，circ ADAMTS13在肝細胞癌中上調(diào)，可抑制肝細胞癌的細胞增殖[6]。有研究證實，直腸癌中circVAPA上調(diào)抑制正常癌細胞的生長過程[7]。還有研究顯示circRNA-0001283通過MiR-187 / HIPK3軸抑制乳腺癌的增殖和侵襲[8]。本研究中，NSCLC患者circHIPK3表達在癌組織中較癌旁正常組織顯著增加，在患者血漿較健康體檢者顯著增加。NSCLC患者組織circHIPK3的表達水平與腫瘤組織分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征相關(guān)。以上提示circHIPK3促進NSCLC的進展。

CircRNA有可能成為惡性腫瘤診斷和預后的潛在的生物分子標志物。有研究報道，circFoxO3a的低表達與腫瘤更深的基質(zhì)浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性有關(guān)，且血漿circFoxO3a表達較低的宮頸癌患者預后較差，其可以作為鱗狀宮頸癌潛在的新型無創(chuàng)性預后生物標志物和治療靶標[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，circHIPK3的過表達在體外顯著抑制了骨肉瘤細胞的增殖，遷移和侵襲，circ-HIPK3可能成為骨肉瘤診斷和治療靶標的新型潛在生物標志物[10]。還有研究證明hsa-circ-0001649在直腸癌中下調(diào)，與癌組織病理分化呈負相關(guān)，是直腸癌潛在的新型生物標志物[11]。本研究中，NSCLC組織circHIPK3的ROC曲線下面積為0.890，靈敏度=90.3%，特異度=68.5%；NSCLC患者血漿circHIPK3的ROC曲線下面積為0.829，靈敏度=79.6%，特異度=83.3%。而血清CEA、SCC-Ag對NSCLC的診斷特異性較高，可能超過90%，但它們的敏感性低，易導致漏診和延誤治療。以上提示circHIPK3有可能成為NSCLC診斷的生化標志物。此外，NSCLC癌組織circHIPK3表達水平與腫瘤組織分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，高表達患者有較低的生存率。Cox回歸分析表明，circHIPK3高表達是NSCLC預后差的獨立的危險因素。以上提示circHIPK3促進腫瘤進展并影響其預后，有可能作為評估NSCLC預后的生物標志物和治療靶標。

抽血檢驗分子標志物簡便易行、風險低、痛苦小、花費低，是理想的檢驗手段。但目前臨床檢測NSCLC的腫瘤標志物，如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、鱗狀細胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)、糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)、糖類抗原153(carbohydrate antigen 153，CA153)等，靈敏度低和特異性差，無法滿足臨床的需求。CircRNA在細胞中含量豐富，高度保守，具有組織特異性表達，而且非常穩(wěn)定，是理想的診療和預后的生物分子標志物。此外，支氣管鏡或經(jīng)皮穿刺活檢獲得的組織行病理聯(lián)合circHIPK3檢測，能夠提高NSCLC的確診率。CircHIPK3在NSCLC患者癌組織和血漿中表達水平顯著增高，且與NSCLC患者預后相關(guān)，均提示circHIPK3有可能是NSCLC的診療的分子標志物和潛在的治療靶標。

本研究的局限性在于樣本量小，實驗結(jié)果需擴大樣本量進一步證實，并且circHIPK3在NSCLC的作用機制需進一步研究。多數(shù)NSCLC就診晚和早期發(fā)生的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NSCLC治療效果不佳的重要原因。在真實世界中，臨床缺乏NSCLC診療更有效的方法和藥物。因此，尋找更高效、敏感的生物學標志物和治療靶標成為亟待的需求。CircHIPK3有可能成為NSCLC診斷和預后生物學標志物的潛在靶標，為肺癌的診療提供新的思路，對促進基礎(chǔ)circRNA研究轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用具有重要的意義。