侯培培，于 倩，矯 妮，孟 錦，欒 波

(遼寧省人民醫(yī)院/中國醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院，遼寧 沈陽 110016)

冠心病慢性心衰主要臨床表現(xiàn)為體循環(huán)或肺循環(huán)淤血、器官組織血液灌注不足，它是心血管疾病的終末期表現(xiàn)和最主要死因[1]。隨著人口老齡化及生活水平的發(fā)展，慢性心衰引發(fā)的心律失常、心源性死亡等不良預(yù)后成為重大公共問題[2]。因此，尋找一種用于慢性心衰預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物十分必要。微小RNA-214(miR-214)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈異常表達(dá)，與動脈粥樣硬化斑塊破裂有重要聯(lián)系[3]。半乳糖凝集素-3(galectin-3)在免疫和炎性反應(yīng)、動脈粥樣硬化等過程中發(fā)揮重要作用，且研究表明，galectin-3在心衰病理生理學(xué)方面有一定作用[4]。因此，本研究通過分析老年冠心病慢性心衰患者血清miR-214、galectin-3水平與心衰相關(guān)臨床指標(biāo)間的關(guān)系，以期為不良預(yù)后的早期預(yù)測提供參考指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2017年7月至2019年4月于本院心內(nèi)科住院治療的72例老年冠心病慢性心衰患者為研究對象(心衰組)，年齡60～88歲，平均(73.23±10.79)歲，男34例，女38例，合并高血壓26例，合并高脂血癥20例；同期選取健康體檢者84例作為對照組，年齡60～87歲，平均(72.87±10.52)歲，男46例，女38例。兩組之間性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究所有受試者均簽署知情同意書，且經(jīng)遼寧省人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合慢性心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，左心衰竭診斷要點(diǎn)：有咳嗽、勞力性呼吸困難、陣發(fā)性夜間呼吸困難、肺靜脈瘀血，右心衰竭診斷要點(diǎn)：體位性水腫、靜脈壓升高、肝臟腫大；②病例資料齊全者；③未進(jìn)行過放療、化療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有感染性疾病及腫瘤者；②伴有嚴(yán)重肝腎功能不全者；③近1周內(nèi)使用抗炎藥物、免疫抑制劑者；④伴有其它血液系統(tǒng)及自身免疫疾病者；⑤6個月內(nèi)發(fā)生過腦卒中、不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死、急性腦血管意外者。查閱門診及住院病歷，收集所有受試者一般資料，包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、肌酐水平、吸煙史等。

1.2主要試劑與儀器:RNA提取試劑盒(批號：R1200-100)購自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：KL266)購自上?？道噬锟萍加邢薰荆籱iScript SYBR?Green Mix熒光定量PCR試劑盒(批號：218073)購自德國QIAGEN公司；氨基N末端B型利鈉肽前體(NT-proBNP)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號：YB-E1449)購自上海鈺博生物科技有限公司；galectin-3 ELISA試劑盒(批號：EY-D9212)購自上海一研生物科技有限公司。實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(型號：Stratagene Mx3005P)購自上海普迪生物科技有限公司；彩色多普勒超聲診斷儀(型號：EPIQ7C)購自荷蘭飛利浦公司。

1.3研究方法

1.3.1樣品采集及保存:采集體檢者體檢當(dāng)天及慢性心衰患者入院第2天晨起空腹肘靜脈血樣5mL，3000r/min離心15min后收集血清，置于-80℃保存待測。

1.3.2血清miR-214水平測定:采用RNA提取試劑盒提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄得cDNA，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用qRT-PCR法檢測血清中miR-214表達(dá)水平，采用qRT-PCR儀對miR-214及其內(nèi)參U6進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系共20μL：cDNA模板(50ng/μL)2μL，miScript SYBR?Green Mix10μL，上下游引物(10μM)各0.8μL，ddH2O 6.4μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，40個循環(huán)。miR-214及內(nèi)參U6的引物序列見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。每份樣品均設(shè)3個重復(fù)孔，采用2-△△CT法計(jì)算血清miR-214相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3血清galectin-3及心功能指標(biāo)測定:采用彩色多普勒超聲診斷儀檢查心功能指標(biāo)左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)及左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)。采用ELISA法檢測血清galectin-3、NT-proBNP水平。

1.3.4隨訪:慢性心衰患者出院12個月內(nèi)以電話等方式隨訪，收集了解患者心血管事件發(fā)生情況，包括心衰復(fù)發(fā)、心律失常、心源性死亡，根據(jù)是否發(fā)生上述事件將慢性心衰患者分為心血管事件組23例和非心血管事件組49例。

2 結(jié) 果

2.1對照組與心衰組一般資料比較:對照組與心衰組性別、年齡、BMI、吸煙比例、肌酐水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 對照組與心衰組一般資料比較

2.2對照組與心衰組血清miR-214、galectin-3水平及心功能指標(biāo)比較:心衰組miR-214、galectin-3、LVESD、LVEDD、NT-proBNP高于對照組，LVEF低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 對照組與心衰組血清miR-214 galectin-3水平及心功能指標(biāo)比較

2.3慢性心衰患者血清miR-214、galectin-3水平與心功能指標(biāo)相關(guān)性:Pearson法分析結(jié)果顯示，慢性心衰患者血清中miR-214、galectin-3水平與LVESD、LVEDD、NT-proBNP呈正相關(guān)(P<0.05)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 慢性心衰患者血清miR-214 galectin-3水平與心功能指標(biāo)相關(guān)性

2.4不同預(yù)后慢性心衰患者血清miR-214、galectin-3水平及心功能指標(biāo)比較:心血管事件組miR-214、galectin-3、LVESD、LVEDD、NT-proBNP高于非心血管事件組，LVEF低于非心血管事件組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 不同預(yù)后慢性心衰患者血清miR-214 galectin-3水平及心功能指標(biāo)比較

2.5影響慢性心衰患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析:將慢性心衰患者是否發(fā)生不良心血管事件作為因變量，以miR-214、galectin-3、LVEF、LVESD、LVEDD、NT-proBNP為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示miR-214、galectin-3是影響慢性心衰患者發(fā)生不良心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，LVEF是影響慢性心衰患者發(fā)生不良心血管事件的保護(hù)因素(P<0.05)，見表6。

表6 影響慢性心衰患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

微小RNA(miRNA)可通過調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)因子，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移等，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管新生，影響缺血性心腦血管疾病[6,7]。趙寧等[8]研究表明，miR-214可通過抑制血管新生等作用，加劇心力衰竭的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，慢性心衰患者血清miR-214高于健康人群，與陳勁松等[9]研究結(jié)果中miR-214的表達(dá)趨勢一致；慢性心衰患者中發(fā)生心血管事件患者血清miR-214高于未發(fā)生心血管事件患者，且miR-214是影響慢性心衰患者發(fā)生不良心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示miR-214可能通過高表達(dá)參與心衰的發(fā)生、發(fā)展，推測可能是miR-214高表達(dá)后抑制人體血管新生，加重心衰患者病情，影響預(yù)后；或miR-214的高表達(dá)使得基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1表達(dá)水平升高，進(jìn)而以微粒體形式釋放入血，二者共同調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)，從而參與心衰發(fā)生、發(fā)展，導(dǎo)致心衰患者發(fā)生心血管事件。

galectin-3可誘導(dǎo)I型膠原沉積、成纖維細(xì)胞增殖以及心室功能不全，且能作為心肌重構(gòu)和纖維化的生物標(biāo)記物[10]。galectin-3可參與心肌中巨噬細(xì)胞的浸潤，進(jìn)而影響心力衰竭[11]。本研究結(jié)果中慢性心衰患者血清galectin-3高于健康人群，且慢性心衰患者中發(fā)生心血管事件患者血清galectin-3高于未發(fā)生心血管事件患者，且galectin-3是影響慢性心衰患者發(fā)生不良心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與秦榕蔚等[12]研究結(jié)果基本一致。推測其可能機(jī)制為：galectin-3高表達(dá)后促進(jìn)心肌巨噬細(xì)胞浸潤，增加膠原沉積，導(dǎo)致心肌順應(yīng)性減低、心肌肥厚，進(jìn)而促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生；galectin-3高表達(dá)可調(diào)節(jié)炎癥水平和心肌纖維化，導(dǎo)致心肌重構(gòu)，而心肌重構(gòu)和心肌纖維化是心力衰竭的病理基礎(chǔ)，間接影響心力衰竭發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。丁才智等[13]研究顯示，LVEF、LVESD等與心力衰竭密切相關(guān)，本研究與其結(jié)果基本一致。此外，本研究中慢性心衰患者血清中miR-214、galectin-3水平與LVESD、LVEDD、NT-proBNP呈正相關(guān)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步提示miR-214、galectin-3可能通過影響LVEF等心功能指標(biāo)的變化，間接參與慢性心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，miR-214、galectin-3水平的變化對慢性心衰疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后均有重要意義，可能會成為冠心病慢性心衰潛在的治療靶點(diǎn)。但miR-214、galectin-3影響冠心病慢性心衰的具體作用機(jī)制仍需深入探究，同時還需進(jìn)一步探索miR-214、galectin-3的實(shí)際臨床應(yīng)用價值。