梁秀軍，代俊利，李 強(qiáng)，郭亞春，高亞賢，宋鴻儒

(1.承德醫(yī)學(xué)院，河北 承 德 067000 2.河北省承德市中心醫(yī)院，河北 承 德 067000 3.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種具有持續(xù)性并反復(fù)發(fā)作的自身免疫性疾病，病變以滑膜炎為主，后期可造成關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞。RA的具體發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明，近年來研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在RA中發(fā)揮著重要作用[1]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一組T細(xì)胞亞群，其功能主要為負(fù)向免疫調(diào)節(jié)，可以抑制免疫細(xì)胞對抗原的呈遞功能、減少細(xì)胞炎性因子的產(chǎn)生和抗體的分泌，對自身免疫病有抑制作用，對于維持免疫內(nèi)環(huán)境的平衡起到重要作用[2]。Treg細(xì)胞特異性表達(dá)叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子p3(foxhead box protein 3, Foxp3)，Treg細(xì)胞發(fā)揮抗炎、抑制效應(yīng)細(xì)胞的過度反應(yīng)和維持免疫耐受的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用，主要是通過細(xì)胞相互直接接觸性抑制和抑制性細(xì)胞因子的分泌(如IL-10、TGF-β)[3]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)穿龍薯蕷皂苷元可以抑制膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis, CIA)鼠關(guān)節(jié)炎癥及滑膜血管新生，對RA發(fā)揮治療作用[4]。本研究通過觀察磁珠分選后的CIA小鼠脾臟中Treg細(xì)胞比例、Foxp3和IL-10的水平變化，初步探討穿龍薯蕷皂苷元對Treg細(xì)胞的影響及可能機(jī)制，為尋找穿龍薯蕷皂苷治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的新靶點及穿龍薯蕷的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物：30只雄性DBA1/J小鼠，SPF級，7～8周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號碼：SCXK(滬) 2012-0002。

1.2主要試劑與儀器：Chicken type Ⅱcollagen(Chondrex公司，美國)；Freund’s completed adjuvant(SIGMA公司，美國)；CD4+CD25+Treg cell 分選試劑盒(Miltenyi Biotec公司，德國)；CD3/CD28 MACSiBead(Miltenyi Biotec公司，德國)；rIL-2(Peprotech公司，美國)；小鼠Treg細(xì)胞染色試劑盒(Ebioscience公司，美國)；SYBR Premix Ex TaqTM II 試劑盒、Foxp3引物、GAPDH引物(中國大連寶生物工程有限公司)：Foxp3-F：5'-AGTGCCTGTCCTCAATGGTC-3'、Foxp3-R：5'-AGGGCCAGCATAGGCAAG-3'；GAPDH-F：5'-AGGTCGGTGAACGGATTTG-3'、GAPDH-R：5'-TGTAGACCATGTAGGAGTTTG-3'；mouse IL-10 ELISA kit(武漢華美生物工程有限公司，中國)；穿龍薯蕷皂苷元(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，中國)；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)；熒光定量 PCR 儀(上海宏石公司，中國)；全自動酶標(biāo)儀(伯騰儀器有限公司，美國)。

1.3CIA小鼠模型建立：將雞Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ, CⅡ)溶于0.05moL/L的冰醋酸中，在冰浴下攪拌使之充分溶解，質(zhì)量濃度為2g/L，然后與弗氏完全佐劑(FCA)等體積混合、乳化，以乳劑在水中不分散為標(biāo)準(zhǔn)，制成CⅡ乳劑。無菌條件下在小鼠背部、尾根部皮內(nèi)多點注射該乳劑，0.1mL/只。第21天，再加強(qiáng)注射一次，0.1mL/只。用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index, AI)為標(biāo)準(zhǔn)判斷模型是否成功[5]。認(rèn)定AI值≥4分的小鼠為造模成功，將AI值<4分的小鼠從實驗中剔除。

1.4制備CIA小鼠脾細(xì)胞懸液：CIA模型小鼠脾臟在無菌條件下被切取，超凈工作臺下置于培養(yǎng)皿中(含有RPMI-1640培養(yǎng)液)。用400目鋼網(wǎng)包裹后，用無齒彎鑷輕輕擠壓脾臟，直至無脾組織塊。用移液管吸取濾液后，再次過400目鋼網(wǎng)收集濾液。裂紅液裂解紅細(xì)胞后，300g離心，10min，再用PBS洗滌2次，調(diào)整至實驗所需的細(xì)胞數(shù)。

1.5免疫磁珠分離法(MACS)分選Treg細(xì)胞：取上述脾淋巴細(xì)胞懸液，用CD4+CD25+Biotin-Antibody標(biāo)記脾臟淋巴細(xì)胞，4℃孵育10 min。加Anti-Biotin磁珠和CD25-PE Antibody混勻，避光15min。加Buffer離心后重懸細(xì)胞，過LD分離柱，分離得到CD4+T細(xì)胞。用Buffer重懸CD4+T細(xì)胞，加Anti-PE混勻，4℃避光15min。加Buffer離心后重懸細(xì)胞，過MS分離柱，分選得到CIA小鼠脾臟CD4+CD25-T細(xì)胞和CD4+CD25+Treg細(xì)胞。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg細(xì)胞的純度：取Treg細(xì)胞嚴(yán)格按照小鼠Treg細(xì)胞染色試劑盒說明書對其進(jìn)行染色，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測MACS法獲得的Treg細(xì)胞的純度。

1.7Treg細(xì)胞體外培養(yǎng)：96孔板中種Treg細(xì)胞(1×105個/孔)，各孔培養(yǎng)基中加入CD3/CD28 MACSiBead(3×105個)和rIL-2(2000U/mL)體外培養(yǎng)。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg細(xì)胞比例：將CIA小鼠Treg細(xì)胞分別分為穿龍薯蕷皂苷元高(25μmoL/L)、中(12.5μmoL/L)、低(6.25μmoL/L)劑量組[5]和空白對照組四組。培養(yǎng)48h后，收集各組細(xì)胞。按照小鼠Treg細(xì)胞染色試劑盒說明書對其進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞術(shù)檢測分析各組Treg細(xì)胞的比例。

1.9實時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的水平：細(xì)胞分組同1.8。細(xì)胞培養(yǎng)48h后，收集各組細(xì)胞。采用實時熒光定量PCR方法檢測各組Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3水平。

1.10ELISA法檢測IL-10的水平：細(xì)胞分組同1.8。培養(yǎng)48h后，用ELISA方法檢測各組細(xì)胞上清中IL-10的水平。

2 結(jié) 果

2.1成功建立CIA小鼠模型：小鼠加強(qiáng)免疫21d后，小鼠體重減輕，多處小潰瘍在小鼠背部、尾根部皮內(nèi)注射處形成，小鼠足爪充血紅腫，運動明顯受限。造模后26只小鼠的AI指數(shù)達(dá)4分以上，成模率為86.7%(26/30)。見圖1。

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圖1 CIA模型小鼠足爪和正常小鼠足爪

2.2MACS法分選的Treg細(xì)胞結(jié)果：MACS法分選出的Treg細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測得純度為91.66±0.12，純度達(dá)90%以上。見圖2。

圖2 Treg細(xì)胞的純度

2.3各組Treg細(xì)胞比例結(jié)果：穿龍薯蕷皂苷元作用MACS分選后的CIA小鼠Treg細(xì)胞48h，與空白對照組相比，穿龍薯蕷皂苷元組Treg細(xì)胞比率顯著升高(P<0.05)。見圖3，表1。

圖3 穿龍薯蕷皂苷元作用后各組Treg細(xì)胞

2.4各組Foxp3 mRNA表達(dá)的結(jié)果：穿龍薯蕷皂苷元作用MACS分選后的CIA小鼠Treg細(xì)胞48h，與空白對照組相比，穿龍薯蕷皂苷元組Foxp3 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.5各組IL-10水平的結(jié)果：穿龍薯蕷皂苷元作用MACS分選后的CIA小鼠Treg細(xì)胞48h，與空白對照組相比，穿龍薯蕷皂苷元組細(xì)胞上清中IL-10水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

表1 穿龍薯蕷皂苷元對各組Treg細(xì)胞比例影響

表2 穿龍薯蕷皂苷元對各組細(xì)胞Foxp3 mRNA的影響

表3 穿龍薯蕷皂苷元對各組細(xì)胞上清中IL-10水平的影響

3 討 論

RA是一種常見的致畸率很高的自身免疫病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。Treg細(xì)胞是以表達(dá)CD4、CD25和Foxp3而命名的一類細(xì)胞，最顯著功能是免疫抑制，其數(shù)量的增減以及功能的改變與多種疾病(自身免疫性疾病、感染、腫瘤等)密切相關(guān)[2]。

RA是以細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)失衡為主的自身免疫病，Treg細(xì)胞在RA病程中的作用成為近年來研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)RA組患者的Treg細(xì)胞比率較健康對照組有所下降[6]。RA患者Treg細(xì)胞還存在對CTLA-4介導(dǎo)的T細(xì)胞受體信號抑制的缺陷[7]。過繼性Treg細(xì)胞免疫療法成為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的前沿療法[8]。Foxp3是Treg細(xì)胞最特異的標(biāo)記物，調(diào)控其生長、發(fā)育和免疫抑制功能，能反映Treg細(xì)胞的表達(dá)水平及細(xì)胞活性。IL-10是Treg細(xì)胞發(fā)揮抑制作用的主要細(xì)胞因子之一，它作用于多種免疫細(xì)胞，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，限制炎癥引起的過度組織破壞。

目前，尚無對RA根治的藥物，多以緩解改善風(fēng)濕癥狀的DMARDs藥為主，且不良反應(yīng)大。穿山龍作為傳統(tǒng)中藥，其具有舒筋活血、祛風(fēng)、止咳平喘等功能?！额愖C治裁曰》“穿山龍，甘緩苦降，性溫能通，活血舒筋，祛風(fēng)止疼，用于各種風(fēng)寒濕痹”。民間常用其水煎劑治療關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕痛等取得較好的療效。本課題組前期研究證明穿龍薯蕷皂苷能緩解CIA模型鼠足爪腫脹程度、降低炎性細(xì)胞因子的表達(dá)、調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞亞群[9，10]，對治療RA具有一定作用。由于皂苷在機(jī)體內(nèi)代謝后，最終被機(jī)體吸收并發(fā)揮治療作用的有效成分是皂苷元，故本研究采用薯蕷皂苷元作為實驗藥物。CIA動物模型是RA經(jīng)典動物模型，本研究采用免疫磁珠分離法分選出CIA小鼠脾臟高純度的Treg細(xì)胞，直接對其進(jìn)行藥物研究，穿龍薯蕷皂苷元的作用更明確。本實驗結(jié)果表明穿龍薯蕷皂苷元能顯著提高CIA小鼠脾臟Treg細(xì)胞的比例、轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和相關(guān)細(xì)胞因子IL-10的水平，為明確穿龍薯蕷皂苷對RA治療的具體作用機(jī)制及新靶點確定提供實驗依據(jù)。