嚴(yán) 謹(jǐn)，陳小鳳，熊金萍，蔣佳辰，夏鳳霞，何九宏

重慶市渝北區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物科，重慶 401120

在開展新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)核酸檢測(cè)的工作中，生物檢材有極強(qiáng)的傳染性，給實(shí)驗(yàn)室操作人員帶來(lái)較大的生物安全隱患和心理壓力。冠狀病毒不耐高溫，嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒在56 ℃、30 min，70 ℃、15 min時(shí)已經(jīng)失活[1]，這提示可以采取高溫方式滅活SARS-CoV-2來(lái)保護(hù)實(shí)驗(yàn)操作人員的生物安全。SARS-CoV-2和SARS病毒同屬β屬冠狀病毒，理化性質(zhì)具有參考性，但溫度過(guò)高可能會(huì)對(duì)核酸完整性產(chǎn)生破壞，降低PCR檢測(cè)效果，另外，考慮到溫度傳導(dǎo)速度，本研究選擇56 ℃、35 min和65 ℃、15 min兩組試驗(yàn)條件。已有研究顯示，使用56 ℃、30 min處理咽拭子標(biāo)本滅活病毒對(duì)后續(xù)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)無(wú)明顯影響[2]，但由于標(biāo)本量少且循環(huán)閾值(Ct值)較低，無(wú)法對(duì)Ct值較高的標(biāo)本是否具有相同的一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此本研究將探討不同Ct值標(biāo)本，特別是Ct值較高的標(biāo)本在不同滅活溫度處理后對(duì)檢測(cè)SARS-CoV-2核酸的結(jié)果是否存在影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本中心2020年1月25日至2月25日采集的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本14份。

1.2試劑與儀器 達(dá)安基因SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?，批?hào)：2020018)，達(dá)安基因核酸提取和純化試劑(DA0633)，達(dá)安Stream全自動(dòng)核酸提取儀，Applied BiosystemsTMQuantStudioTM7 Flex實(shí)時(shí)定量PCR儀，Eppendorf ThermoMixerTMC振蕩器。

1.3方法 實(shí)驗(yàn)人員按照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[3]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和生物安全防護(hù)。(1)各標(biāo)本取病毒采樣液210 μL分裝到3個(gè)EP管中，做好標(biāo)記，由于恒溫金屬浴溫度波動(dòng)系數(shù)更小[4]，標(biāo)本間不易污染，分別用Eppendorf ThermoMixerTMC振蕩器56 ℃、35 min，65 ℃、15 min滅活處理。(2)核酸提取和體系配制使用達(dá)安Stream全自動(dòng)核酸提取儀以及配套提取試劑(DA0633)。(3)核酸擴(kuò)增使用Applied BiosystemsTMQuantStudioTM7 Flex 實(shí)時(shí)定量 PCR 儀，每批結(jié)果設(shè)陰陽(yáng)性對(duì)照，在陰陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果正常的情況下，結(jié)果有效。每個(gè)測(cè)試設(shè)置3次復(fù)孔，取平均Ct值進(jìn)行計(jì)算。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)SARS-CoV-2的開放讀碼框1ab(ORF1ab)和核衣殼蛋白(N)基因在未滅活組和滅活組中的Ct值通過(guò)Anderson-Darling、D′Agostino-Pearson、omnibus、Shapiro-Wilk、Kolmogorou-Smirnou進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，P>0.05符合正態(tài)分布。對(duì)不同溫度滅活的Ct值差異采用非參數(shù)檢驗(yàn)的Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1未滅活處理及不同溫度滅活處理后標(biāo)本的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 對(duì)標(biāo)本進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，見(jiàn)表1。對(duì)未滅活組和不同溫度滅活組的結(jié)果進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-WhitneyU分析，結(jié)果顯示，56 ℃、35 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值與未滅活組Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=95.50、95.00，P>0.05)，65 ℃、15 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值與未滅活組Ct值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=94.00、94.50，P>0.05)，56 ℃、35 min和65 ℃、15 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=96.00，P>0.05)。

表1 不同滅活溫度處理對(duì)ORF1ab和N基因Ct值的影響

2.2不同Ct值標(biāo)本在不同滅活溫度處理下對(duì)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果的影響 本研究選擇了Ct值≥34和Ct值<34的標(biāo)本在未滅活和不同滅活溫度處理下的熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-WhitneyU分析。對(duì)于Ct值≥34的標(biāo)本，結(jié)果顯示，56 ℃、35 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值與未滅活組Ct值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=31.50、31.00，P>0.05)，65 ℃、15 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值與未滅活組Ct值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=14.00、15.00，P>0.05)，56 ℃、35 min和65 ℃、15 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=16.00，P>0.05)。

對(duì)于Ct值<34的標(biāo)本在未滅活和不同滅活溫度方式下進(jìn)行熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示，56 ℃、35 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值與未滅活組Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=16.00、16.00，P>0.05)，65 ℃、15 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值與未滅活組Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=24.00、23.00，P>0.05)，56℃、35 min和65℃、15 min滅活處理組的ORF1ab和N基因Ct值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=32.00，P>0.05)。

3 討 論

生物安全是開展病原微生物操作處理工作必須考慮的首要因素，在標(biāo)本的采集以及核酸提取過(guò)程中要采取相應(yīng)的防護(hù)措施或應(yīng)在一定生物安全防護(hù)等級(jí)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2可能的傳播方式是經(jīng)飛沫傳播、接觸傳播以及呼吸道氣溶膠近距離傳播[5]，由于在相對(duì)密閉的環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在氣溶膠傳播的可能，加大了實(shí)驗(yàn)室操作人員感染的風(fēng)險(xiǎn)。為減少病毒的生物危害，研究者對(duì)高壓[6]、超聲波[7]、伽馬射線照射[8]、乙醇等方式處理標(biāo)本進(jìn)行探討，但這些方法需要額外的設(shè)備或試劑，且可能降低核酸檢測(cè)的敏感性，同時(shí)，各實(shí)驗(yàn)室條件不盡相同，不易推廣。SARS-CoV-2是一種包膜脂質(zhì)病毒，對(duì)溫度敏感，高溫處理標(biāo)本簡(jiǎn)單易行，對(duì)降低實(shí)驗(yàn)室人員感染風(fēng)險(xiǎn)有重要意義，但由于高溫可能會(huì)使標(biāo)本RNA降解，影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，目前，市面上SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒檢出限大都在500～1 000 copy/mL，陽(yáng)性判讀Ct值在30～40[9]，對(duì)于灰區(qū)標(biāo)本，由于接近試劑盒本身檢出限，樣品處理不當(dāng)可能會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果假陰性。本研究結(jié)果表明，56 ℃、35 min和65 ℃、15 min恒溫金屬浴滅活處理灰區(qū)標(biāo)本對(duì)后續(xù)核酸檢測(cè)結(jié)果并無(wú)明顯影響，為后續(xù)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)提供了不同的策略。分析原因，核酸降解的因素眾多，首先SARS-CoV-2是單鏈RNA病毒，不如雙鏈DNA穩(wěn)定；其次，細(xì)胞的內(nèi)源性RNA酶和外源性RNA酶較多，且活性強(qiáng)，高溫使RNA酶活性增強(qiáng)，不利于RNA病毒的提取和保存。然而，商品化核酸提取試劑的裂解液對(duì)RNA酶有充分的滅活作用[10]，降低了高溫對(duì)核酸降解的不利影響。雖然高溫對(duì)病毒滅活效果較好，但研究表明不同蛋白溶液和穩(wěn)定劑對(duì)滅活效果存在影響[11]。因此，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員在處理標(biāo)本的過(guò)程中仍然應(yīng)按照生物安全三級(jí)防護(hù)要求做好個(gè)人防護(hù)。