李 婧，李林靜，劉 轉，楊文娟，馬青梅，張安安，楊海棠，劉欣躍

蘭州大學第二醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，甘肅蘭州 730030

華法林是使用最為廣泛的口服抗凝藥，也是治療心腦血管疾病的常用藥物，主要用于預防和治療血栓栓塞性疾病，如心房顫動、人工心臟瓣膜置換術后、腦梗死、深靜脈血栓等[1]。但華法林存在治療窗狹窄[2-3]、劑量差異大[4]、影響因素多[5]、反應難預測[6-7]等特點，因此在使用過程中容易發(fā)生出血或栓塞等不良事件。目前最常用的華法林初始給藥法為基于經驗的固定劑量方案。隨著藥物基因組學研究的深入，遺傳因素與華法林劑量個體差異的關系已得到廣泛認可[8-10]。2007年美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)更改了華法林的說明書，在開始進行華法林抗凝治療的患者中，有必要檢測細胞色素P450超家族第二亞家族C9代謝酶(CYP2C9)和維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體亞單位1(VKORC1)的基因型[11-12]。

根據ISO15189 實驗室質量管理體系對實驗室項目開展的要求，任何一個用于常規(guī)檢測的新系統(tǒng)或新項目在使用前必須進行性能驗證[13]，這是保證檢測質量的重要環(huán)節(jié)。根據中國合格評定國家認可委員會(CNAS)制定的有關要求，定性檢測項目的性能驗證指標宜包括符合率、檢出限、抗干擾能力等[14]。因此，本研究以該準則為標準，進一步結合試劑說明書和本實驗室的具體情況，制訂了一套驗證方案從符合率、精密度、檢出限和抗干擾能力4個方面對蘇州曠遠生物分子技術有限公司的人CYP2C9與VKORC1基因多態(tài)性檢測試劑盒(熒光PCR法)進行性能驗證。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取蘭州大學第二醫(yī)院2017年10月至2018年5月因心房顫動或心臟瓣膜病需行人工心臟瓣膜置換術且初次使用華法林，同時未使用其他溶栓藥物治療的患者20例，其中男9例、女11例，平均年齡(65.5±4.7)歲，所有患者無家族遺傳史，無血緣關系。

1.2儀器與試劑 核酸提取試劑盒(蘇州曠遠生物分子技術有限公司)，人CYP2C9與VKORC1基因多態(tài)性檢測試劑盒(熒光PCR法，蘇州曠遠生物分子技術有限公司)，實時熒光定量PCR儀(美國ABI 7500)，核酸定量儀(美國Life公司Qubit3)。

1.3方法

1.3.1外周血DNA提取 采集所有患者靜脈血2～3 mL后EDTA-K2抗凝，4 ℃保存，采用柱提法提取DNA，DNA濃度均大于50 ng/μL、純度(A260 nm/A280 nm)為1.8～2.0，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2熒光PCR擴增 按照蘇州曠遠生物分子技術有限公司的人CYP2C9與VKORC1基因多態(tài)性檢測試劑盒(熒光PCR法)的要求檢測CYP2C9基因c.1075位點(A/C)與人VKORC1基因-1639位點(G/A)核苷酸多態(tài)性，同時使用試劑盒自帶的質控品做陰陽性對照。采用ABI 7500實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增。設置FAM和VIC雙通道采集熒光信號。對于DNA樣本檢測反應體系，其內參擴增曲線的Ct(VIC)值應≤20，在內參Ct(VIC)值正常的情況下，計算樣本檢測信號Ct(FAM)值與內參信號Ct(VIC)值的差值，即ΔCt=Ct(FAM)-Ct(VIC)，根據ΔCt值判斷基因型。

1.3.3符合率驗證 驗證方案為使用蘇州曠遠生物分子技術有限公司的人CYP2C9與VKORC1基因多態(tài)性檢測試劑盒對上述已知20例基因型標本進行熒光PCR法檢測基因型，同時，將DNA標本送至北京六合華大基因科技有限公司上海分公司進行Sanger測序檢測基因型，然后比較兩種方法的符合情況，要求符合率≥95%為驗證通過。

1.3.4精密度驗證 包含批內精密度和批間精密度驗證，熒光PCR法檢測CYP2C9與VKORC1的基因分型精密度用每個通道檢測的Ct值的變異系數(CV)表示。要求CYP2C9 c.1075 A、CYP2C9 c.1075 C、VKORC1-1639 G，VKORC1-1639 A反應體系FAM和VIC熒光通道的Ct值的CV均≤5%為驗證通過。以下為驗證方案：選擇1例已知基因型為雜合型的標本(CYP2C9 c.1075 AA、VKORC1-1639 GA)，將該標本在同一批次試驗中連續(xù)測定5次。計算其均值(MEAN1)、標準差(SD1)與變異系數(CV1)，為批內精密度；將該標本連續(xù)測定3 d，每批內測定5次，共測定15次。計算其均值(MEAN2)、標準差(SD2)與變異系數(CV2)，為批間精密度。

1.3.5檢出限驗證 選擇2例雜合型標本，基因型分別為CYP2C9 c.1075 AA、VKORC1-1639 GA和CYP2C9 c.1075 AC、VKORC1-1639 GA，根據試劑盒說明書“參考品(雜合子)最低檢測下限低至10 ng/μL”，將這兩例標本核酸濃度稀釋到10 ng/μL以下，上機檢測，重復5次，要求5次檢測基因型結果與未稀釋原濃度的基因型結果符合率達100%為驗證通過。

1.3.6抗干擾能力驗證 選擇1例已知基因型的血液標本，基因型為CYP2C9 c.1075 AA、VKORC1-1639 AA，分裝成10份標本，每份200 μL，其中1份不添加任何干擾物質，設為對照組；其余9份平均分為3組，每組分別加入3種干擾物質，即血紅蛋白、膽紅素和膽固醇，每組重復檢測3次(終濃度為廠家申明的最高干擾濃度)，各試驗組和對照組檢測結果的符合率≥90%表示抗干擾能力驗證通過。

2 結 果

2.1符合率驗證結果 20例標本經過熒光PCR和Sanger測序之后，顯示CYP2C9與VKORC1均有3種基因型，2種基因組合之后有4種基因型，兩種方法檢測的結果完全一致，符合率達100%，驗證通過，見表1。

表1 CYP2C9和VKORC1經熒光PCR和Sanger測序后符合率驗證結果

續(xù)表1 CYP2C9和VKORC1經熒光PCR和Sanger測序后符合率驗證結果

2.2精密度驗證結果 所選擇的雜合型標本經過5次批內精密度檢測，結果顯示，CYP2C9兩個等位基因A和C的FAM和VIC熒光通道檢測CV1值分別為1.14%、1.60%、4.69%和0.58%，均小于5%；VKORC1兩個等位基因G和A的FAM和VIC熒光通道檢測CV1值分別為2.27%、1.26%、1.67%和1.50%，均小于5%；該雜合型標本連續(xù)測定3 d，每批重復測定5次，合計15次重復檢測的批間精密度結果顯示，CYP2C9兩個等位基因A和C的FAM和VIC熒光通道檢測CV2值分別為0.85%、0.73%、2.94%和0.48%；VKORC1兩個等位基因G和A的FAM和VIC熒光通道檢測CV2值分別為2.48%、1.66%、3.56%和3.47%；以上4組CV值均小于5%，批內和批間精密度驗證均符合要求，見表2、3。

表2 CYP2C9和VKORC1經熒光PCR測定批內精密度驗證結果

表3 CYP2C9和VKORC1經熒光PCR測定批間精密度驗證結果

續(xù)表3 CYP2C9和VKORC1經熒光PCR測定批間精密度驗證結果

2.3檢出限驗證結果 所選擇的2例雜合型標本濃度均大于50 ng/μL，經過稀釋后，2例標本的DNA濃度均稀釋到小于10 ng/μL，分別為9.56 ng/μL和9.44 ng/μL，重復檢測5次后得到的基因型與未稀釋原濃度的基因型完全符合，驗證通過，見表4。

表4 CYP2C9和VKORC1經熒光PCR測定檢出限驗證結果

2.4抗干擾能力驗證結果 1份已知基因型(CYP2C9 c.1075 AA、VKORC1-1639 AA)的臨床標本加入3種干擾物質，配制血紅蛋白終濃度為20 g/L，總膽紅素終濃度為60 μmol/L、總膽固醇終濃度為10.1 mmol/L，結果表明加入血紅蛋白、膽紅素和膽固醇之后標本的基因型與對照組基因型完全符合，符合率為100%，驗證通過，見表5。

表5 CYP2C9和VKORC1熒光定量PCR抗干擾能力驗證結果

3 討 論

CYP2C9參與抗凝血藥華法林的羥化代謝，它的基因多態(tài)性可影響華法林在體內的藥物濃度。CYP2C9*3(A1075C)是亞洲人群中最主要的基因多態(tài)性，中國人群中CYPC2C9*3的分布頻率約為4%[15]。維生素K氧化還原酶是抗凝藥物華法林的作用靶點，維生素K環(huán)氧化物還原酶復合物1的編碼基因VKORC1-1639 G>A的單核苷酸多態(tài)性可通過影響VKORC1表達，從而影響華法林的敏感性。VKORC1-1639A等位基因頻率在中國人群中高達90%[16]。所以本研究在標本選擇上盡可能多的包含了中國人群中出現(xiàn)的各種基因型。

符合率驗證試驗中，兩種檢測方法共檢測出CYP2C9基因18例純合野生，1例雜合突變，1例純合突變；VKORC1基因1例純合野生，8例雜合突變，11例純合突變；以上兩種基因組合之后共檢測出4種基因型組合。熒光PCR檢測結果與基因突變檢測的“金標準”Sanger測序結果完全一致，表明該試劑盒符合率符合要求。

精密度檢測驗證試驗中，包含了批內精密度和批間精密度的驗證。雜合型標本(CYP2C9 c.1075 AA、VKORC1-1639 GA)在批內同時檢測5次后，其CV值均小于5%；同一標本每批測定5次，連續(xù)3 d共測定15次的批間精密度結果顯示，其CV值均小于5%，表明該試劑盒精密度驗證符合要求。

檢出限指可以準確判斷基因型的最低基因組DNA濃度。本試劑盒說明書中判定10 ng/μL為最低檢出限，因此，本研究將基因組DNA稀釋至10 ng/μL以下進行檢測，結果表明稀釋后的基因組DNA的熒光PCR檢測結果與稀釋前結果完全一致，表明該試劑盒最低檢出限驗證符合要求。

抗干擾能力是指臨床標本中的溶血、黃疸和脂血現(xiàn)象對檢測結果不產生影響的能力。血液標本的血紅蛋白、總膽紅素和總膽固醇的濃度根據廠家申明的最高干擾濃度配制，加入3種干擾物質的基因分型結果與不加任何干擾物質的對照組基因分型結果完全一致，表明試劑盒抗干擾能力良好。

綜上所述，蘇州曠遠生物分子技術有限公司的人CYP2C9與VKORC1基因多態(tài)性檢測試劑盒(熒光PCR法)的符合率、精密度、檢出限和抗干擾能力驗證均符合ISO15189的要求，以上驗證已經可以在保證項目驗收的基礎上，為臨床提供可靠的檢測結果，更好地為患者服務。如果條件允許，還可以在性能驗證中使用其他無關位點突變的標本或質控品進行交叉反應試驗，進一步完善性能驗證結果。