李 姚，王靖超，袁加琪，溫 浩，周 瀛，樊海寧，王志鑫

1 青海大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，西寧 810000；2 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化血管外科中心肝膽包蟲(chóng)外科，烏魯木齊 830000

棘球蚴病存在于我國(guó)西部多個(gè)省份，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所對(duì)我國(guó)青海、四川、云南等9個(gè)省抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，流行區(qū)域的患病率為0.28%[1]。肝泡型包蟲(chóng)病(hepatic alveolar echinococcosis，HAE)可以經(jīng)淋巴道和血管轉(zhuǎn)移到腹膜后和遠(yuǎn)隔器官如腦、肺等，故有“蟲(chóng)癌”之稱(chēng)[2-3]。該病目前仍是世界范圍內(nèi)一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[4-5]。

肝包蟲(chóng)病發(fā)病初期癥狀不明顯，癥狀出現(xiàn)后病情會(huì)快速加重[6-7]。目前切除手術(shù)是治療肝包蟲(chóng)病的最佳手段，藥物治療的效果有限。因此，尋找到新的治療方法和藥物非常重要。有研究[8]表明，硼替佐米(bortezomib，BTZ)對(duì)包蟲(chóng)病小鼠的原頭節(jié)和后絳幼蟲(chóng)有殺滅作用，其作用機(jī)制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)有關(guān)。本項(xiàng)課題初步研究HAE中ERS與部分炎癥介質(zhì)的相關(guān)性，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年6月—2019年9月因HAE在青海大學(xué)附屬醫(yī)院接受肝臟部分切除術(shù)的患者15例，切除HAE病灶邊緣帶作為AE組，同期肝臟正常組織15例作為對(duì)照組。

1.2 檢測(cè)指標(biāo) 采集AE組病灶邊緣帶和正常肝組織，并收集一般臨床資料，采用Western Blot檢測(cè)病灶邊緣帶和正常組織中蛋白激酶R樣激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT-enhancerbindingproteinε, CHOP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12(cysteine-containing aspartate-specific proteases 12,caspase-12)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP-78)的表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測(cè)病灶邊緣帶和正常組織中IL-6、IL-9、TNF的表達(dá)。

1.3 主要儀器及試劑 主要儀器有冷凍離心機(jī)(heal force，neofuge 13R)、轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠(chǎng)，DYCZ-40D)、qRT-PCR儀(ABI，Stepone plus)、超微量分光光度計(jì)(Thermo，Thermo)。主要試劑包括RIPA裂解液、50*cooktail、PMSF、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、HRP標(biāo)記二抗、RNA提取液、FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)等。

1.4 檢測(cè)方法和步驟

1.4.1 Western Blot法檢測(cè)步驟 將肝組織塊洗滌后剪成小塊置于勻漿管中徹底勻漿。將勻漿完成的樣本管取出，進(jìn)行冰浴、震蕩確保組織完全裂解。離心后收集上清，即為總蛋白溶液。配制分離膠，加入TEMED后搖勻灌膠。凝固后開(kāi)始電泳，然后轉(zhuǎn)膜。加入一抗后孵育過(guò)夜，洗滌加入二抗，孵育、洗滌后經(jīng)化學(xué)發(fā)光、顯影和定影，使用Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值，即蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.4.2 相關(guān)蛋白和炎癥因子mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 取100 mg組織，加入到有1 ml Trizol Reagent的勻漿管中。離心后取上清。加入三氯甲烷，充分混勻，靜置。再次離心后管底的白色沉淀即為總RNA。然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。目的基因表達(dá)陽(yáng)性的標(biāo)本熒光定量擴(kuò)增曲線(xiàn)呈S形，從qRT-PCR儀系統(tǒng)中讀取CT值。結(jié)果處理ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待測(cè)樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本)，B=CT(目的基因，對(duì)照樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本)，K=A-B，表達(dá)倍數(shù)=2-K?；蛞镄蛄幸?jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.5 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：P-SL-2019072，所有納入患者均簽署知情同意書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 ERS相關(guān)蛋白表達(dá)水平 AE組PERK、CHOP、caspase-12和GRP-78表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 兩組間ERS相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

2.2 ERS相關(guān)指標(biāo)mRNA的表達(dá)水平 AE組的PERK、CHOP、caspase-12和GRP-78的 mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表3)。

表3 兩組間ERS相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá)水平的比較

2.3 炎癥介質(zhì)mRNA的表達(dá)水平 AE組IL-1β、IL-6、TNF的 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表4)。

表4 兩組間相關(guān)炎癥介質(zhì)mRNA表達(dá)水平的比較

2.4 ERS蛋白與炎癥介質(zhì)相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析ERS相關(guān)蛋白與IL-1β、IL-6、TNF的相關(guān)性，結(jié)果顯示PERK、CHOP、capcase12、GRP-78與IL-6、IL-1β、TNF具有正相關(guān)性(P值均<0.05)(表5)。

表5 ERS相關(guān)蛋白與炎癥介質(zhì)的相關(guān)性

3 討論

棘球蚴感染導(dǎo)致嚴(yán)重的慢性人畜共患寄生蟲(chóng)疾病，在畜牧養(yǎng)殖地區(qū)廣泛流行[9]。此病仍是一個(gè)世界公共衛(wèi)生問(wèn)題[10]。阿苯達(dá)唑是目前唯一用于包蟲(chóng)病術(shù)前術(shù)后的口服藥物[11]，由于其療效差、并發(fā)癥多，找到新的治療藥物成為重要問(wèn)題。據(jù)Nicolao等[12]研究，硼替佐米對(duì)多房棘球蚴蟲(chóng)具有高水平的殺傷作用。硼替佐米作為一種用于骨髓瘤化療的蛋白酶體抑制劑[13-14]，雖然有研究[15]表明其對(duì)多房棘球蚴蟲(chóng)具有殺傷作用，但此藥物仍然不能在HAE臨床治療中使用，這還需要更多進(jìn)一步的研究。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中必不可少的細(xì)胞器，其膜結(jié)構(gòu)占細(xì)胞內(nèi)膜的1/2，在內(nèi)膜系統(tǒng)中占有非常重要的地位[16]。損傷因子作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，造成蛋白質(zhì)加工、運(yùn)輸障礙或鈣吸收、釋放障礙，導(dǎo)致各種蛋白質(zhì)的重疊、折疊式蛋白堆積和細(xì)胞內(nèi)的鈣離子不均衡，從而激活重疊的蛋白反應(yīng)，即非折疊蛋白反應(yīng)。而非折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)通路通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑引起細(xì)胞損傷甚至死亡[17-18]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上有3種能夠感受到腔內(nèi)未折疊蛋白堆積的特殊蛋白質(zhì)感受器，分別為PERK、IRE-1、ATF6[19]。PERK是一種跨膜蛋白，具有N端應(yīng)力傳感結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域[20]。IRE1是最保守的壓力傳感器,有兩個(gè)亞型(IRE1α、IRE1β)存在于哺乳動(dòng)物[21]。ATF6是一種跨膜蛋白，具有胞質(zhì)bZIP轉(zhuǎn)錄因子域，包含兩種哺乳動(dòng)物亞型ATF6α、ATF6β[22]。當(dāng)其激活時(shí),ATF6α通過(guò)蛋白酶裂解S1P、S2P,釋放胞質(zhì)片段,遷移到核調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[23]。雖然內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在肝細(xì)胞中的作用已被廣泛研究，但其在肝臟非實(shí)質(zhì)部分的功能尚未被探索[24]。因此，研究可能影響肝臟炎癥和細(xì)胞ERS的相關(guān)因素具有重要意義。

在HAE中包蟲(chóng)的存活和侵襲能力可能與非折疊蛋白反應(yīng)有關(guān)[25]。為了保護(hù)肝臟免受包蟲(chóng)的損害可以恢復(fù)正常的蛋白穩(wěn)態(tài)。一些治療方案可以轉(zhuǎn)錄重組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以繼續(xù)保護(hù)機(jī)體不暴露于折疊不當(dāng)?shù)姆置诘鞍?，而不是?dǎo)致過(guò)度的ERS引起的炎癥和細(xì)胞死亡。因此，在肝臟系統(tǒng)生理和病理反應(yīng)之間保持平衡穩(wěn)態(tài)，以?xún)?nèi)質(zhì)網(wǎng)為治療靶點(diǎn)是目前可能的藥物治療方向。

肝臟的損傷和破壞是由于細(xì)胞過(guò)多的死亡和肝組織中基質(zhì)的過(guò)量損失而表現(xiàn)出來(lái)的。胞體壓力本身促進(jìn)了ERS，與炎癥反應(yīng)有進(jìn)一步的相互作用，可以通過(guò)炎癥反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的水解。但是具體的調(diào)節(jié)機(jī)制不明確。

在本研究中，基于相關(guān)研究分析了HAE邊緣帶組織中ERS表現(xiàn)的變化。結(jié)果顯示，在AE組肝臟邊緣的PERK、CHOP、caspase-12、GRP-78的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，表明HAE的肝組織中ERS的表現(xiàn)明顯更為活躍，提示ERS的過(guò)度活化與HAE的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。各種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)肝細(xì)胞及其周?chē)M織，分泌大量的炎癥介質(zhì)使炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大。IL-1β、IL-6、TNF是活性化后浸潤(rùn)到肝組織的炎癥介質(zhì)。在AE組中IL-1β、IL-6、TNF的分泌量明顯高于對(duì)照組，表明HAE病情的發(fā)展以及對(duì)肝細(xì)胞和肝組織的破壞與炎癥介質(zhì)有關(guān)。ERS相關(guān)蛋白PERK、CHOP、caspase-12、GRP-78與炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF呈正相關(guān)性，提示ERS和HAE炎癥反應(yīng)存在一定程度的相關(guān)，ERS促進(jìn)了HAE的發(fā)展。因此筆者認(rèn)為，HAE中ERS的激活與炎癥介質(zhì)的活性化存在相關(guān)性，ERS的過(guò)度激活能夠改變部分炎癥介質(zhì)的分泌來(lái)加劇肝損傷，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究?？笶RS治療有望成為HAE藥物治療的潛在方式。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：李姚、王靖超、袁加琪、溫浩、周瀛、樊海寧、王志鑫負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)、資料分析；李姚、王靖超負(fù)責(zé)收集數(shù)據(jù)與撰寫(xiě)論文；李姚、王靖超、王志鑫參與修改論文；溫浩、周瀛、樊海寧、王志鑫責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)論文并最后定稿。