葛焰，王偉，劉潔玉，曾博

(西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州646000)

電刺激心臟起搏是廣泛用于臨床治療和實(shí)驗(yàn)室研究的心臟起搏技術(shù)，基本作用原理為使用起搏器即電脈沖信號發(fā)生器向局部心肌組織直接施加特定頻率的電刺激，使該區(qū)域心肌細(xì)胞膜電位去極化，產(chǎn)生動(dòng)作電位并將興奮傳導(dǎo)至相鄰區(qū)域的心肌組織，使心臟激動(dòng)和收縮(Roth，1994)。雖然電刺激心臟起搏器已經(jīng)在臨床應(yīng)用上取得了很大的成功，但是在實(shí)驗(yàn)室研究，特別是使用小鼠作為疾病模型的心律失常研究中電刺激起搏還存在明顯的技術(shù)缺陷，如只能用于引發(fā)動(dòng)作電位的短暫去極化，不能長時(shí)間持續(xù)刺激(Bruegmannetal.，2010)；導(dǎo)致不同部位的心肌產(chǎn)生不均勻的去極化和超極化區(qū)域(Gillisetal.，1996)；電刺激作用于目標(biāo)區(qū)域的所有細(xì)胞，包括心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌浸潤的巨噬細(xì)胞等，不能選擇性作用于心肌細(xì)胞(Zagliaetal.，2019)；電解組織液產(chǎn)生氫氣、氧氣、氯氣等組織損傷性氣體并改變局部pH值等(Merrilletal.，2005)。為了避免以上問題，需要開發(fā)新的心臟起搏技術(shù)對電刺激技術(shù)進(jìn)行補(bǔ)充或替代。

光遺傳學(xué)(Deisserothetal.，2006)是利用基因重組技術(shù)，將光敏感的生物元件導(dǎo)入細(xì)胞、組織或個(gè)體中，對特定的生物學(xué)功能進(jìn)行研究的新型技術(shù)手段，目前使用最多的光遺傳學(xué)工具是視紫紅質(zhì)通道蛋白2 (channelrhodopsin-2，ChR2)，該蛋白是一種藍(lán)光激活的陽離子通道(Nageletal.，2003)，將ChR2表達(dá)于可興奮的靶細(xì)胞或靶器官上，利用一定強(qiáng)度的藍(lán)光將其激活開放即可實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、組織、器官及動(dòng)物生理功能的精細(xì)調(diào)控(Lerneretal.，2016；Leeetal.，2020)。心臟光遺傳學(xué)是一個(gè)新興的研究方向(Jiaetal.，2011)，一般是指將ChR2特異性表達(dá)于心肌細(xì)胞上，通過藍(lán)光照射使ChR2通道開放，胞外陽離子流入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞膜電位去極化，從而引發(fā)心肌細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位，電活動(dòng)可以從少數(shù)心肌細(xì)胞向周圍相鄰的心肌細(xì)胞傳導(dǎo)，最終使整個(gè)心臟興奮和收縮(Entcheva，2013)?；谝陨显?，本研究使用心肌特異性Cre重組酶表達(dá)小鼠與ChR2融合tdTomato熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交獲得了心肌特異性ChR2-tdTomato表達(dá)小鼠，并使用藍(lán)光照射對小鼠的心臟搏動(dòng)進(jìn)行了精確控制，成功構(gòu)建了光控小鼠心臟起搏模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物αMHC-Cre和ChR2(H134R)-tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson Laboratory，在西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物房進(jìn)行繁育[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2018-17,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SCXK(川)2018-065]，飼養(yǎng)過程中給予充足的飲水和飼料。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，在醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2 試劑NaOH、Tris-HCl、瓊脂糖、核酸染料、D2000 DNA Marker和TAE緩沖液購自生工生物工程(上海)股份有限公司，2×Es Taq MasterMix購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，小鼠基因型鑒定引物由北京擎科生物科技有限公司成都分公司合成，麻醉藥物戊巴比妥鈉由西南醫(yī)科大學(xué)統(tǒng)一訂購分配使用。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖策略研究使用的αMHC-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠為αMHC啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的心肌特異性Cre重組酶表達(dá)小鼠，ChR2(H134R)-tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠在通用型CAG啟動(dòng)子和ChR2(H134R)-tdTomato融合基因之間插入了2個(gè)LoxP位點(diǎn)和STOP終止序列，在沒有Cre重組酶的情況下，ChR2(H134R)-tdTomato不表達(dá)。將2種轉(zhuǎn)基因小鼠雜交后，在心肌細(xì)胞中表達(dá)的Cre重組酶對2個(gè)LoxP位點(diǎn)進(jìn)行剪切和重組，中間的STOP序列被切除，ChR2(H134R)-tdTomato融合蛋白得以表達(dá)(圖1)。ChR2(H134R)是ChR2的突變體，在藍(lán)光刺激下具有更高的活性，產(chǎn)生約2倍的光電流，去極化作用更顯著(Nageletal.，2005)，但是基本特性與ChR2相同，后文中將其簡稱為ChR2。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定2種轉(zhuǎn)基因小鼠及其雜交后代的基因型鑒定使用αMHC-Cre和ChR2特異性引物(表1)對鼠尾DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)產(chǎn)物電泳結(jié)果判斷基因型。鼠尾DNA提取采用堿裂解法，取鼠尾(0.5～1 mm)于300 μL 50 mmol·L-1NaOH溶液中，100 ℃金屬浴30 min，冷卻后加入25 μL 1 mol·L-1Tris-HCl (pH8.0)混勻，用作PCR模板。PCR體系(20 μL)：ddH2O 7 μL，引物各1 μL，模板DNA 1 μL，2×Es Taq MasterMix 10 μL。PCR程序：95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，63/57 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 min，10 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后成像分析。

表1 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定引物Table 1 Genotyping primers of transgenic mice

1.2.3 小鼠心臟熒光表型鑒定取成年小鼠腹腔注射0.2 mL 1%戊巴比妥鈉溶液，麻醉后手術(shù)開胸暴露心臟，用561 nm LED光源照射整個(gè)胸腔(圖2：A)，使用590～650 nm波段濾光片和普通相機(jī)捕獲tdTomato熒光并成像(圖2：B、C)。

1.2.4 小鼠光控心臟起搏取成年小鼠腹腔注射0.2 mL 1%戊巴比妥鈉溶液，待小鼠麻醉約15 min后行氣管插管(呼吸頻率130次/min，呼吸時(shí)比5∶4，潮氣量2 mL)，手術(shù)開胸后暴露心臟，將藍(lán)光刺激器對準(zhǔn)心臟，使用針灸針穿刺四肢皮膚，連接導(dǎo)線進(jìn)行心電圖記錄(圖2：D、E)。

2 結(jié)果

2.1 雜交小鼠基因型和熒光表型

將αMHC-Cre小鼠和ChR2-tdTomato小鼠進(jìn)行雜交獲得了αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+(心肌特異性表達(dá)Cre和ChR2-tdTomato)、αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato-(心肌特異性表達(dá)Cre但不攜帶ChR2-tdTomato基因)和αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+(不表達(dá)Cre，攜帶ChR2-tdTomato基因但由于上游終止序列的存在而無法表達(dá))3種基因型的小鼠。在561 nm LED光源的激發(fā)下(圖2：A)，αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠的心臟發(fā)出明亮的紅色熒光且在其他部位沒有熒光(圖2：B)，說明ChR2-tdTomato融合蛋白在該基因型小鼠心臟中具有組織特異性的高水平表達(dá)。同樣條件下，αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+小鼠心臟及其他部位均沒有明顯的熒光，說明ChR2-tdTomato沒有表達(dá)。

2.2 心臟自主搏動(dòng)小鼠的光控起搏

心肌表達(dá)ChR2-tdTomato的αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠在連接呼吸機(jī)和開胸后，在沒有藍(lán)光刺激的情況下，心臟自主搏動(dòng)的頻率約為4 Hz(圖3：A)；當(dāng)給予小鼠心臟2 Hz的藍(lán)光刺激時(shí)，原先的自主搏動(dòng)節(jié)律被打亂，出現(xiàn)明顯的心律失常(圖3：B)；當(dāng)藍(lán)光刺激頻率與自主搏動(dòng)頻率相同時(shí)，心跳頻率維持在4 Hz(圖3：C)；當(dāng)使用6 Hz藍(lán)光刺激頻率時(shí)，心臟搏動(dòng)完全由光照支配，且表現(xiàn)為竇性心律(圖3：D)；當(dāng)藍(lán)光刺激頻率提高至 8 Hz 時(shí)，心跳頻率也隨之變?yōu)? Hz，但出現(xiàn)了短暫的心律失常(圖3：E)；當(dāng)使用10 Hz的藍(lán)光刺激時(shí)，小鼠心肌已不能承受快速的去極化，雖然心臟搏動(dòng)仍較為規(guī)律，但心電圖波形已出現(xiàn)嚴(yán)重的紊亂(圖3：F)。當(dāng)撤除藍(lán)光刺激之后，無論之前使用了何種刺激頻率，小鼠心臟均可迅速恢復(fù)到4 Hz的自主搏動(dòng)狀態(tài)。

2.3 心臟停跳小鼠的光控起搏

為了檢測因缺血損傷而無法自主搏動(dòng)的心臟對藍(lán)光刺激的反應(yīng)，本研究將αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠麻醉后不連接呼吸機(jī)直接開胸，待心臟停跳后進(jìn)行藍(lán)光刺激，當(dāng)刺激頻率為1～5 Hz時(shí)，藍(lán)光刺激可以有效引發(fā)小鼠心臟的搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率與刺激頻率完全一致(圖4：A～C)。當(dāng)藍(lán)光刺激頻率為7.5～10 Hz時(shí)，由于可能存在的心肌損傷，小鼠心率僅能維持在4～5 Hz內(nèi)，無法進(jìn)一步提高(圖4：D～F)。以上結(jié)果說明光遺傳學(xué)技術(shù)具有起搏停跳心臟的能力，起搏效果可能與心肌損傷的程度密切相關(guān)。

2.4 對照小鼠對藍(lán)光刺激無響應(yīng)

為了確認(rèn)αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠心臟的光控起搏是由心肌表達(dá)的ChR2引發(fā)的，本研究還對αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato-和αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+2種不表達(dá)ChR2-tdTomato的對照小鼠進(jìn)行了同樣的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2種小鼠對5 Hz和10 Hz的藍(lán)光刺激均沒有響應(yīng)，心率一直維持在6 Hz(圖5)，這說明ChR2的表達(dá)是心臟光控起搏的決定因素。

3 討論

光遺傳學(xué)是一種新興的通過光敏感生物元件來控制生物學(xué)功能的技術(shù)手段，目前已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究中，極大地促進(jìn)了更為精細(xì)的神經(jīng)元分類、投射和功能研究(Rajasethupathyetal.，2016)。然而，目前在心臟電生理研究中光遺傳學(xué)的應(yīng)用還較少，Arrenberg等(2010)在斑馬魚Daniorerio上實(shí)現(xiàn)了心臟節(jié)律的光遺傳學(xué)控制，借助黃光激活的陰離子通道halorhodopsin(NpHR)(Schobert &Lanyi，1982)和藍(lán)光激活的ChR2成功構(gòu)建了心動(dòng)過速、心動(dòng)過緩、房室傳導(dǎo)阻滯和心臟驟停等疾病模型。同時(shí)，ChR2也被證明可以在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)光控心臟起搏(Bruegmannetal.，2010)。在體外培養(yǎng)的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞上聯(lián)合使用ChR2與遺傳編碼的鈣離子和膜電位熒光探針，可以實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的起搏及鈣瞬變和膜電位同步記錄，從而進(jìn)行高通量的藥物心臟毒性檢測(Dempseyetal.，2016)。除了直接對心肌細(xì)胞進(jìn)行光遺傳學(xué)操控，在交感神經(jīng)上表達(dá)ChR2并進(jìn)行光刺激可以使離體的小鼠心臟的搏動(dòng)加快、收縮增強(qiáng)，更易發(fā)生心律失常(Wengrowskietal.，2015)。與之相對，在交感神經(jīng)上表達(dá)光驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子外流泵ArchT(Hanetal.，2011)，可以顯著抑制交感神經(jīng)的興奮并保護(hù)動(dòng)物免于發(fā)生心律失常(Yuetal.，2017)。另外，利用光遺傳學(xué)技術(shù)，心臟浸潤的巨噬細(xì)胞也被發(fā)現(xiàn)在心臟電活動(dòng)傳導(dǎo)尤其是房室傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用(Hulsmansetal.，2017)。

利用心肌組織特異性表達(dá)ChR2的轉(zhuǎn)基因小鼠，本研究也對使用光遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)行心臟節(jié)律控制進(jìn)行了探討，不僅驗(yàn)證了藍(lán)光刺激ChR2對正常狀態(tài)小鼠心臟的精準(zhǔn)調(diào)控，還對因缺血損傷停止搏動(dòng)的小鼠心臟進(jìn)行了不同頻率的起搏測試，發(fā)現(xiàn)短時(shí)停跳的心臟在藍(lán)光刺激下也有產(chǎn)生搏動(dòng)的能力。由于本研究使用的LED藍(lán)光刺激器光斑較大，無法將照射范圍控制在心臟局部較小范圍，未能比較對竇房結(jié)、心房、心室等不同部位進(jìn)行藍(lán)光刺激的效果差異，這是本研究的一個(gè)重要局限，在后期研究中可以通過使用光斑較小的激光光源進(jìn)行多部位刺激和更深入的探討。此外，伴隨單細(xì)胞測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，越來越多的心肌細(xì)胞亞型也已被發(fā)現(xiàn)(Zhou &Zhang，2020)，構(gòu)建并使用各細(xì)胞亞型特異性的Cre小鼠結(jié)合ChR2光遺傳學(xué)刺激(Wangetal.，2017)，將有助于理解各亞型心肌細(xì)胞的電生理特性差異，是深入理解心臟功能和心律失常的發(fā)生機(jī)制的重要技術(shù)手段。