王平，劉洋，黃偉，劉傳炯

(1.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，成都610081；2.畫(huà)稿溪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理處，四川瀘州646405)

2020年4月，在四川瀘州畫(huà)稿溪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)海拔660 m的溪流附近，采集到4號(hào)(標(biāo)本號(hào):HGX2020022～HGX2020025)角蟾科Megophryidae標(biāo)本(圖1)，周?chē)h(huán)境為苦竹Pleioblastusamarus與落葉闊葉混交林，微生境為流水崖壁下、石下以及有流水的草本植物叢中。結(jié)合分子系統(tǒng)發(fā)育重建及形態(tài)比較，確定該4號(hào)標(biāo)本為角蟾科掌突蟾屬Leptobrachella的畢節(jié)掌突蟾Leptobrachellabijie，系四川省兩棲類(lèi)新記錄種。

1 方法

根據(jù)費(fèi)梁和葉昌媛(2001)的測(cè)量方法，對(duì)4號(hào)標(biāo)本進(jìn)行了測(cè)量與記錄，其他物種的形態(tài)數(shù)據(jù)來(lái)自Wang等(2019)。

將其中2號(hào)標(biāo)本利用OMEGA試劑盒提取DNA，利用引物L(fēng)3957/H4551(Simonetal.，1994)擴(kuò)增16SrDNA基因序列。擴(kuò)增體系為25 μL，95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，10 ℃結(jié)束。擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州金唯智公司測(cè)序，利用LaserGene.v7.1(DNASTAR Inc.，美國(guó))及MEGA 7(Kumaretal.，2016)對(duì)獲得的序列進(jìn)行處理?；跍y(cè)序獲得的序列片段、在NCBI上下載的部分掌突蟾屬物種以及外群東方鋤足蟾Pelobatessyriacus、摩洛哥鋤足蟾Pelobatesvaraldii序列，利用MrBayes 3.2.2(Ronquistetal.，2012)，最佳進(jìn)化模型為GTR+I+G，由Partitionfinder 2.1.1基于A(yíng)kaike Information Criterion (AIC)計(jì)算所得，及RaxmlGUI 1.5(Silvestro &Michalak，2012)，模型為GTRGAMMA，bootstrap設(shè)為1 000，其他參數(shù)保持默認(rèn)，分別重建所采集標(biāo)本的貝葉斯法和最大似然法系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹(shù)。同時(shí)利用MEGA 7計(jì)算物種及種群間的遺傳距離，使用模型為Kimura 2-parameter，其他參數(shù)保持默認(rèn)。

2 結(jié)果

4號(hào)標(biāo)本體長(zhǎng)為30.5～33.6 mm；背部棕褐色，具小疣粒；體側(cè)具稀疏的不規(guī)則黑斑點(diǎn)；腿及前臂背面具3～4條褐色橫紋；前后肢腹面紫黑色，具較密集的不規(guī)則灰白色斑點(diǎn)；腹部白色，具淡灰色斑點(diǎn)；腋腺白色；指間無(wú)蹼，趾間微蹼。

獲得2條16SrDNA堿基序列，長(zhǎng)度為564 bp。重建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和最大似然樹(shù)一致顯示，該4號(hào)標(biāo)本與畢節(jié)掌突蟾的模式標(biāo)本聚為一支(圖2)，并享有0.7%的遺傳距離。

3 討論

結(jié)合形態(tài)比較及分子系統(tǒng)發(fā)育研究，本次采自畫(huà)稿溪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的4號(hào)標(biāo)本均為畢節(jié)掌突蟾，為四川省兩棲類(lèi)新記錄。

掌突蟾屬具有非常高的潛在物種多樣性，近幾年，我國(guó)學(xué)者至少描述了該屬17個(gè)新種(中國(guó)兩棲類(lèi)，2020)。另一方面，掌突蟾屬物種形態(tài)保守性非常高，使得僅靠形態(tài)比較進(jìn)行分類(lèi)研究往往導(dǎo)致誤鑒定，不同的物種常常被鑒定為同一物種，并認(rèn)為其廣泛分布。利用綜合的研究手段對(duì)掌突蟾屬物種進(jìn)行分類(lèi)與分布研究應(yīng)該提上日程。

致謝：本工作得到了畫(huà)稿溪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的支持，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)陳重光在野外工作中的幫助，宜賓學(xué)院郭鵬教授在分子實(shí)驗(yàn)上的幫助，在此一并致謝！