王碧霞，陳正元，澤仁達瓦，吳玉環(huán)，頓 珠，方佳敏，熊天琴

(1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510000；2.西藏藏醫(yī)藥大學，西藏 拉薩 850000)

藏醫(yī)作為具有2000多年歷史的傳統(tǒng)醫(yī)學，對肝病有著獨特的認識[1]，其認為肝病誘發(fā)外因多由感受濕熱疫毒之邪所致，內因則與患者正氣虛弱有關.藏醫(yī)將肝病分為寒熱兩種，其中慢性肝病為寒性肝病，臨床表現(xiàn)為脈象遲緩，尿現(xiàn)寒象，肝端不顫，肌色青黃，肝端薄長，食欲不振，消化力下降，大便色白而稀薄等[2-3].

現(xiàn)代醫(yī)學腸肝軸理論認為，腸和肝臟的關系密切.腸和肝通過多種介質互相影響聯(lián)系，對于黃疸類疾病，膽汁酸是聯(lián)系肝腸的重要介質，膽汁酸腸肝循環(huán)障礙是其主要特征.膽汁酸肝腸障礙，將導致毒性膽汁酸淤積誘發(fā)肝臟和腸道的氧化或炎癥損傷[4]，因此，改善膽汁酸肝腸循環(huán)障礙導致的肝腸炎癥或氧化損傷，對于肝和腸的調控具有重要意義.

藏醫(yī)在臨床實踐中已廣泛用于肝病[5]，藏方甲嘎松湯記載于《四部醫(yī)典》，由干姜、豆蔻、肉豆蔻組成，用于治療寒性肝病.前期研究表明該方可以通過調節(jié)腸肝軸穩(wěn)態(tài)對多種肝損傷動物模型具有確切的保肝作用[1，6-7].

現(xiàn)有的研究中，沒有能有效地反映臨床上寒性肝病表現(xiàn)特征的動物模型.慢性黃疸模型動物出現(xiàn)了較嚴重的膽汁淤積性肝損傷，表現(xiàn)為明顯的炎性浸潤以及膽管增生，但沒有出現(xiàn)大便稀薄的現(xiàn)象，因此擬用刺激性瀉藥番瀉葉，以模擬寒性肝病部分癥狀.基于此，本文通過在采用隔日皮下注射ANIT建立慢性黃疸模型基礎上，期間每日灌胃番瀉葉湯劑建立寒性肝病模型，觀察甲嘎松湯對其肝臟和腸道損傷的改善作用，初步闡明甲嘎松湯對寒性肝病模型腸肝軸的調控作用，為進一步完善腸肝軸理論以及擴大甲嘎松湯臨床應用提供數(shù)據(jù)支撐.

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠，6周齡，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心(許可證號:SCXK(粵)2018-0002)，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學中藥學院實驗動物中心(許可證號:SYXK(粵)2019-0202)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學中藥學院實驗動物中心倫理學審查后進行實驗(廣東省實驗證明編號:00224202).

1.1.2 實驗藥物與試劑

ANIT，上海阿拉丁化科技股份有限公司，批號:N1063891；ALT/GPT試劑盒，批號:C009-2-1，AST/GOT試劑盒，批號:C010-2-1，AKP試劑盒，批號:A059-2-2，TBA試劑盒，批號:E003-2-1，TGSH/GSSG試劑盒，批號:A061-1-2，SOD試劑盒，批號:A001-3-2，MDA試劑盒，批號:A003-1-2，均購自南京建成生物工程研究所有限公司；動物RNA抽提試劑盒(離心柱式)，上海碧云天生物技術有限公司，批號:R0026；TGFβ1 mouse DuoSet Elsia kit，Bio-Techne(中國)有限公司，批號:DY1679-05；MMP2、MMP13、TIMP1、FXR、MRP2、NTCP、NQO1、HO-1和IL-10 qPCR引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Mouse IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet Elsia kit，Bio-Techne(中國)有限公司，批號:DY401；TGF-β1 mouse DuoSet Elsia kit，Bio-Techne(中國)有限公司，批號:DY1679-05.

1.1.3 實驗儀器

全波長酶標分析儀，美國Thermo Fisher Scientific公司，批號:THM51119300；qPCR熒光定量PCR儀，美國Thermo Fisher Scientific公司，批號:ABI7500；激光共聚焦，德國ZEISS，批號:LSM800.

1.1.4 實驗試劑配制

(1)ANIT溶液:稱取適量的ANIT，配制成5 mg/mL的ANIT橄欖油溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用.

(2)番瀉葉湯劑:取適量番瀉葉飲片，加入純水煎煮10 min，紗布過濾后濾液使用旋轉蒸發(fā)儀將濃度濃縮至1 g/mL生藥，4℃?zhèn)溆?

(3)甲嘎松湯:干姜、豆蔻和肉豆蔻打粉，過6號篩(100目)，按干姜:豆蔻:肉豆蔻=6∶5∶4的重量比混勻，配制成0.66 g/kg(0.066 g/mL)的混懸液，煮沸10 min，臨用前混勻.

(4)茵陳術附湯煎劑:以3∶6∶1.5∶1.5∶3∶1的比例將茵陳、白術、附子、干姜、炙甘草，肉桂備用，附子先煎60 min，其余藥后下煎煮30 min，紗布過濾后濾液使用旋轉蒸發(fā)儀將濃度濃縮至1 g/mL.

1.2 實驗方法

1.2.1 寒性肝病模型的建立及藥物組給藥

小鼠隨機分為5組，分別為正常組，慢性黃疸模型組，寒性肝病模型組，茵陳術附湯陽性組(10 g/kg)，甲嘎松湯組(0.66 g/kg).模型及各藥物組隔日早上皮下注射ANIT橄欖油(50 mg/kg)，每天上午寒性肝病模型組、茵陳術附湯組、甲嘎松湯組灌胃番瀉葉湯劑，慢性黃疸模型組給予等量生理鹽水，藥物組每天下午灌胃對應藥物.正常組給予等量生理鹽水.ANIT造模14天后取材.

1.2.2 樣本采集與實驗方法

小鼠眼眶取血后，靜置分離血清，檢測血清中ALT、AST、AKP及TBA含量；取肝最大葉肝尖部位的組織和回腸組織，進行HE染色和Masson染色，并在顯微鏡下觀察其病理形態(tài)改變；通過免疫熒光共定位觀察肝組織中P-Smad2/3的入核情況；取部分肝組織用qPCR熒光定量的方法檢測肝臟中FXR、MRP2、NTCP、MMP2、MMP13、TIMP1的轉錄水平和采用Elisa法測定TGF-β1的含量；取部分回腸組織，通過免疫熒光共定位的方法檢測ZO-1和Occludin的陽性表達；將剩余的小腸組織制備10%的腸勻漿，檢測GSH、GSSG和MDA含量、HO-1、NQO1、FXR、IL-10 mRNA的水平和采用Elisa法測定IL-1β的含量；此外，使用LC-MS進行定量檢測血清中膽汁酸的成分和含量.

1.3 統(tǒng)計學方法

對數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗(Kolmogorov-Smirnov test)及方差齊性檢驗(Bartlett′s test)后，對于符合正態(tài)分布，方差齊的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，組間比較使用多重T檢驗(Tukey′s).對于不符合正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)，使用使用Dunnett’s T3檢驗.P值小于0.05被認為具有統(tǒng)計學差異.使用GraphPad Prism 8.0作圖.

2 實驗結果

2.1甲嘎松湯對寒性肝病模型動物肝損傷的作用

2.1.1對肝臟功能指標的調控

如圖1，與正常組相比，慢性黃疸模型與藏醫(yī)寒性肝病模型的肝功酶ALT、AST、AKP、TBA均顯著升高，但兩者沒有明顯差異.茵陳術附湯和甲嘎松湯均能改善藏醫(yī)寒性肝病模型的肝功酶和血清總膽汁酸的升高.

圖1 甲嘎松湯對寒性肝病模型肝功酶的調控(Mean±SEM，n=8)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術附湯組，JGST甲嘎松湯組，**p＜0.01Fig.1 The regulation of JGST on liver function enzymes inCold-Liver disease model(Mean±SEM，n=8)

2.1.2 對肝臟病理損傷的改變

如圖2，慢性黃疸模型出現(xiàn)炎癥浸潤和膽管增生，寒性肝病模型的炎性浸潤和膽管增生顯著加重，茵陳術附湯和甲嘎松湯能夠改善寒性肝病模型的炎癥浸潤和膽管增生.

圖2 甲嘎松湯對寒性肝病模型病理損傷的改變(200×，n=6)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術附湯組，JGST甲嘎松湯組Fig.2 Effect of JGST on pathological damage of Cold Liver disease model(200×，n=6)

2.1.3 對肝臟膽汁酸蛋白的影響

如圖3所示，慢性黃疸模型及寒性肝病模型會抑制肝臟FXR及其下游蛋白MRP2、NTCP的轉錄，甲嘎松湯和茵陳術附湯能提高FXR、MRP2、NTCP的轉錄水平，提示甲嘎松湯有助于緩解肝臟膽汁酸淤積.

圖3 甲嘎松湯對寒性肝病模型肝臟膽汁酸蛋白的影響(Mean±SEM，n=8)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術附湯組，JGST甲嘎松湯組，*P＜0.05，**P＜0.01.Fig.3 Effect of JGST on bile acid protein in Cold Liver disease model(Mean±SEM，n=8)

2.1.4肝臟Masson染色的改變

寒性肝病模型與慢性黃疸模型比較，膠原沉積增多，膠原容積分數(shù)增大，甲嘎松湯與茵陳術附湯均能改善寒性肝病模型的膠原沉積，如圖4.

圖4 甲嘎松湯對寒性肝病模型Masson染色的改善(200×，n=6)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術附湯組，JGST甲嘎松湯組Fig.4 Improvement of JGST on masson of Cold Liver disease model(200×，n=6)

2.1.5 對TGF-β1/P-Smad通路的影響

如圖5所示，寒性肝病模型P-Smad2/3陽性表達顯著高于正常組和慢性黃疸模型組，甲嘎松湯和茵陳術附湯均能降低P-Smad2/3的入核，降低肝臟TGF-β1的含量，下調αsma的轉錄.

圖5 甲嘎松湯對寒性肝病模型TGF-β1/P-Smad通路的作用注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術附湯組，JGST甲嘎松湯組；P-Smad2/3，n=3，放大倍數(shù)400X；αsma、TGF-β1，n=8；*P＜0.05，**P＜0.01Fig.5 Effect of JGST on TGF-β1/P-Smad pathway in Cold Liver disease model

2.1.6 對纖維化調控因子的作用

寒性肝病模型中纖維化相關因子MMP13和TIMP1的升高，茵陳術附湯能下調MMP13、TIMP1轉錄.甲嘎松湯能降低寒性肝病模型中肝臟MMP2和MMP13的升高，但對TIMP1無明顯作用，如圖6.

圖6 甲嘎松湯對寒性肝病模型纖維化調控因子的作用(Mean±SEM，n=8)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術附湯組，JGST甲嘎松湯組，*P＜0.05，**P＜0.01Fig.6 Effect of JGST on fibrosis regulatory factors of Cold Liver disease model(Mean±SEM，n=8)

2.2 甲嘎松湯對寒性肝病模型動物腸道損傷的作用

2.2.1 腸道屏障損傷的影響

圖7，慢性黃疸模型和寒性肝病模型腸道出現(xiàn)絨毛斷裂，ZO-1和Occludin的表達下降(病變部位如黃色箭頭所示)，其中Occludin在寒性肝病模型表達比慢性黃疸模型稍低(病變部位如黃色箭頭所示).甲嘎松湯和茵陳術附湯均能改善寒性肝病模型的腸絨毛斷裂，增加ZO-1和Occludin的表達.

圖7 甲嘎松湯對寒性肝病模型腸道屏障損傷的作用注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術附湯組，JGST甲嘎松湯組；HE，n=6，放大倍數(shù)100×；ZO-1、Occludin，n=3，放大倍數(shù)400×，病變部位用黃色箭頭表示Fig.7 Effect of JGST on intestinal barrier injury in Cold Liver disease model

2.2.2 對腸道氧化損傷的影響

如圖8所示，慢性黃疸模型和寒性肝病模型的抗氧化酶GSH、NQO1、HO-1較正常組顯著下降，氧化物MDA、GSSG顯著上升，抗氧化指標GSH/GSSG顯著下降.寒性肝病模型相比慢性黃疸模型，GSSG顯著升高，GSH/GSSG顯著下降.甲嘎松湯和茵陳術附湯均能改善上述指標.

圖8 甲嘎松湯對寒性肝病模型腸道氧化損傷的作用(Mean±SEM，n=8)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術附湯組，JGST甲嘎松湯組，*P＜0.05，**P＜0.01Fig.8 Effect of JGST on Intestinal oxidative damage in Cold Liver disease model(Mean±SEM，n=8)

2.2.3 對腸道炎癥的影響

如圖9所示，慢性黃疸和寒性肝病模型上調了致炎因子IL-1β的表達，抑制了抗炎因子IL-10的轉錄.甲嘎松湯、茵陳術附湯均能降低IL-1β的表達，增強抗炎因子IL-10的轉錄.

圖9 甲嘎松湯對寒性肝病模型腸道炎癥損傷的作用(Mean±SEM，n=8)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術附湯組，JGST甲嘎松湯組，**P＜0.01Fig.9 Effect of JGST on intestinal inflammation damage in Cold Liver disease model(Mean±SEM，n=8)

2.2.4 對腸FXR的作用

如圖10，顯示慢性黃疸模型及寒性肝病模型抑制了腸FXR的轉錄，甲嘎松湯、茵陳術附湯能顯著增加腸FXR的轉錄.

圖10 甲嘎松湯對寒性肝病模型腸FXR的作用(Mean±SEM，n=8)注:C正常組，HM慢性黃疸模型組，YM寒性肝病模型組，YF茵陳術附湯組，JGST甲嘎松湯組，**P＜0.01Fig.10 Effect of JGST on intestinal FXR in Cold Liver disease model(Mean±SEM，n=8)

2.3 甲嘎松湯對寒性肝病模型動物血清膽汁酸圖譜的作用

2.3.1 對血清膽汁酸的總體作用

如圖11中OPLS-DA和聚類熱圖主要表現(xiàn)膽汁酸的總體變化，顯示寒性肝病模型與慢性黃疸模型相比，血清膽汁酸成分總體具有明顯差異.甲嘎松湯給藥組與寒性肝病模型組相比，血清膽汁酸圖譜有明顯變化.

3.3.2 對血清膽汁酸差異的作用

如圖12，慢性黃疸模型組與正常組比較，抗炎作用膽汁酸ω-MCA顯著減少，毒性膽汁酸TCA，TβMCA的升高.寒性肝病模型相比慢性黃疸模型，血清中大量膽汁酸成分增加，其中毒性TCA、TLCA、TβMCA的含量較慢性黃疸模型顯著增加.甲嘎松湯給藥后，血清中各類膽汁酸均表現(xiàn)為明顯下降，其中毒性膽汁酸TLCA、DCA、LCA、TCA、TCDCA均減少.

圖11 慢性黃疸模型、寒性肝病模型與甲嘎松湯給藥組血清膽汁酸總體變化注:A為正常組與慢性黃疸模型組的OPLS-DA圖；B為慢性黃疸模型組與寒性肝病模型組OPLS-DA圖；C為肝寒模型組與甲嘎松湯給藥組OPLS-DA圖；D為寒性肝病模型和慢性黃疸模型聚類熱圖；E為甲嘎松湯給藥組與肝寒模型聚類熱圖，n=5Fig.11 Overall change of serum bile acid between chroniccholestasis，cold liver disease and JGST administration group

圖12 慢性黃疸模型、寒性肝病模型與甲嘎松湯給藥組血清膽汁酸差異注:圖A，慢性黃疸模型組與正常組相比，血清差異膽汁酸成分；圖B，寒性肝病模型組與正常組相比，血清差異膽汁酸成分；圖C，甲嘎松湯給藥后為與模型組相比，血清膽汁酸變化；n=5Fig.12 The difference of serum bile acid between chroniccholestasis，cold liver disease and JGST administration group

3 討論

藏醫(yī)理論認為，寒性肝病有食欲不振，消化功能減退，大便稀薄的特征.番瀉葉有瀉下作用，會造成大便稀薄，同時會出現(xiàn)食欲不振、消化酶減少等消化功能減退的癥狀[8].本研究擬采用番瀉葉模擬寒性肝病胃火勢微弱，消化功能減退，大便稀薄的癥狀特征，在慢性黃疸模型的基礎上添加番瀉葉造模.通過檢測肝功酶，觀察肝臟和腸道的病理，以及腸道上皮屏障的改變，結果顯示寒性肝病模型肝臟中堿性磷酸酶、總膽汁酸明顯升高，膽管增生明顯，提示動物出現(xiàn)了黃疸，同時肝臟出現(xiàn)膠原沉積、腸道以及腸上皮屏障的損傷更嚴重，且造模過程中實驗動物出現(xiàn)大便稀薄狀況，提示初步建立了藏醫(yī)的寒性肝病模型.

藏醫(yī)將肝病各種表現(xiàn)癥狀歸納為三種不同癥型，均呈現(xiàn)有皮膚略暗黃或暗黃癥狀.寒性肝病(“培根”癥型)的癥狀，除鞏膜和皮膚略呈暗黃外，伴有消化不良、食欲不振、大便不成形[3].從上述癥狀分析，寒性肝病以慢性黃疸以及腸道損傷為主要病變特征.根據(jù)ANIT的造模原理，其通過誘導膽管上皮釋放炎癥因子誘發(fā)肝臟炎癥，造成肝內膽汁淤積[9].前期研究發(fā)現(xiàn)，多次注射ANIT制備慢性膽汁淤積模型，會出現(xiàn)膽汁酸穩(wěn)態(tài)失衡.腸道中膽汁酸含量異常有可能導致腸道損傷.在寒性肝病模型中，腸道緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達顯著下降，腸絨毛斷裂，致炎因子IL-1β升高，抗炎因子IL-10降低，抗氧化指標GSH/GSSG顯著下降，氧化產(chǎn)物GSSG顯著升高，提示在寒性肝病模型中，腸道出現(xiàn)明顯氧化損傷、炎癥損傷和腸屏障損傷.

現(xiàn)代醫(yī)學腸肝軸理論認為，腸和肝臟的關系密切.腸和肝通過多種介質互相聯(lián)系，其中腸道菌群代謝物和膽汁酸是聯(lián)系肝腸的兩種重要介質[10].對于膽汁淤積作用機制的研究，主要以核受體為靶點.寒性肝病模型中腸膽汁酸受體FXR轉錄被明顯抑制，其下游的ASBT趨勢相同.而ASBT的減少，表明腸道對膽汁酸的重吸收功能減弱.在該模型中，血清膽汁酸成分較慢性模型出現(xiàn)顯著差異.ω-MCA被認為是具有抗炎作用的膽汁酸[11]，TCA和TβMCA被認為對于肝臟有毒性作用[12-13].其中TCA是艱難梭菌的強效誘發(fā)劑，提示了腸道菌群結構的失調[14].在寒性肝病模型中血清ω-MCA的減少，TCA和TβMCA的增多提示膽汁酸的正常轉運被破壞，致使毒性膽汁酸的增多及有益膽汁酸的降低.

腸道損傷影響肝臟主要觀點是“腸漏”學說，其理論在于腸道損傷后，腸道的模式損傷相關分子(PAMPs)，進入肝門靜脈，進而影響肝臟[15]，膽汁酸是PAMPs的一種，其成分和量將通過腸肝循環(huán)影響肝臟.實驗結果提示寒性肝病模型能夠加重腸屏障的損傷，結合“腸漏”學說，提示寒性肝病模型可能是腸道的損傷加劇，腸通透性發(fā)生改變，使更多毒性膽汁酸穿過腸壁進入肝門靜脈，加重膽汁酸肝腸循環(huán)障礙，導致寒性肝病模型的肝纖維化進程加重.

甲嘎松湯為藏族傳統(tǒng)基礎處方，常單獨或聯(lián)合其他中藥用于小兒肝炎、寒性肝炎的治療.藏醫(yī)在治療肝病時，主張治肝先保胃，肝膽脾胃同調理的治療原則[3].實驗觀察到甲嘎松湯能夠改善寒性肝病模型造成的肝損傷并且調節(jié)肝臟的膽汁酸受體FXR，增加膽汁酸轉運蛋白MRP2和NTCP的表達，促進淤積的膽汁外排進腸道，減輕肝臟膽汁淤積.對寒性肝病模型造成的腸道氧化損傷、炎癥損傷和腸屏障損傷均有顯著的改善作用.提示甲嘎松湯能夠通過調理胃腸以改善模型動物的膽汁淤積性肝損傷，其機制可能與通過激活FXR調節(jié)腸肝軸穩(wěn)態(tài)有關.

綜上所述，本研究在慢性黃疸模型基礎上灌胃給予番瀉葉湯劑初步建立了寒性肝病動物模型，同時甲嘎松湯能改善寒性肝病模型的腸肝軸損傷，表現(xiàn)為減輕寒性肝病模型造成的膽汁淤積，改善腸道屏障損傷及氧化炎癥損傷，降低血清中毒性膽汁酸含量，其具體作用機制有待進一步探討.