管博文盧延華白 琳石桂英蘇路路王玉全魏 強王 衛(wèi)孟愛民

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心,北京 100021)

中國在逐步步入老齡化國家,衰老的研究日趨重要。 進入老年后,免疫系統(tǒng)逐漸發(fā)生改變,患炎癥疾病、自身免疫性疾病和惡性腫瘤的風險也隨之上升。 老齡化疾病的發(fā)生及轉歸具有明顯的性別差異,對衰老發(fā)生過程中性別差異的機制受到研究者的關注[1-2]。 SD 大鼠屬于封閉群動物,在遺傳多樣性方面更接近人群,基因,毒理和代謝與人類很接近,封閉環(huán)境和固定的飲食排除了其他干擾因素,為研究衰老過程中的性別差異提供了動物模型[3-4]。

我們在前期研究中比較了自然衰老大鼠與青年大鼠外周血、免疫分型以及P16 表達的差異[5]。本文在前期工作的基礎上,比較分析不同月齡SD大鼠在上述各項指標中的性別差異為衰老和老齡化比較醫(yī)學研究提供基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

使用SPF 級SD 大鼠,8 周齡雄性 5 只、雌性5只,體重范圍分別為 265 ～ 285 g 和 199 ～ 205 g。 12月齡 SPF 級SD 大鼠雄性10 只,雌性10 只,體重分別為 720～970 g 和 360 ～490 g。 所有大鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2020-0004]。 在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所動物房屏障環(huán)境下飼養(yǎng)[SYXK(京)2018-0002],屏障內(nèi)溫度保持在20℃～26℃,保障屏障內(nèi)相對濕度為40%～70%,內(nèi)部壓力大于外部壓力10 Pascal,屏障內(nèi)照明亮度15～20 lm/m2且每隔12 h 晝夜交替一次。 經(jīng)過醫(yī)科院動研所倫理審查委員會的批準(IACUC MAM17001),動物福利依照3R 原則,保障取食飲水等自由[5]。

1.2 主要試劑與儀器

外周血熒光抗體CD4-APC(201509)、CD45RAAPC ( 202313 )、 CD161-FITC ( 205608 ) 購 于BioLegend;CD11b-PE(Mac,MA5-17512)、CD8 PECy7(25 - 0084 - 80) 購于 Thermofisher scientific;CD25-PE(MA1-80772)、CD3-FITC(MA1-81619)購于eBioscience;脾淋巴細胞熒光抗體CD3-FITC(201403)、CD45RA-APC(202313)購于 BioLegend;eBioscienceTM1×RBC Lysis Buffer 購于 Thermofisher scientific Invitrogen(00-4333-57);大鼠T 細胞富集試劑盒購于STEMCELL Technologies(EasySepTMRat T Cell Isolation Kit,#19641);ficoll 分離液購于Solarbio Life Sciences(大鼠脾單個核細胞分離液試劑盒,P4870);全自動血液分析儀 PentraDX120(ABX);BD 流式分析儀(BD FACSAria II)。

1.3 實驗方法

1.3.1 外周血細胞計數(shù)及分類

使用戊巴比妥鈉按照60 mg/kg 進行腹腔注射,麻醉。 腹主動脈取血,抗凝,進行血計數(shù)分類檢測[6]。

1.3.2 免疫臟器指數(shù)

取大鼠大腦、胸腺和脾稱重,按照下述公式計算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。 免疫臟器指數(shù)=臟器重量(g)/大鼠大腦重量(g)。 因性別和月齡的差異,大鼠體重差異較大,故采用臟腦比[7-8]。

1.3.3 外周血免疫細胞分型檢測

取50 μL 外周血,加入 1 mL 紅細胞裂解液,室溫條件下裂解8 min 后離心5 min,條件1500 r/min,4℃。 沉淀,棄上清,保持每個樣本 100 μL 體系,加入抗體,條件 4℃,避光,孵育 30 min。 2 mL PBS 洗一遍,離心條件不變。 加入300 μL PBS 過濾到流式管中,上機檢測[5]。

1.3.4 脾淋巴免疫細胞分型檢測

制備脾細胞懸液。 每個樣品取50 μL 進行檢測。 其余步驟同1.3.3。

1.3.5 脾T 細胞分離及P16 mRNA 表達量檢測

將剩余脾細胞懸液,用ficoll 分離單個核細胞,EasySepTMRat T Cell Isolation Kit 富集 T 細胞。 按照1×106～5×106/mL 的細胞濃度加入 TRIzol,提取總RNA,保存在-80℃。 交由上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司采測定P16 mRNA 的表達量[9]。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)處理和繪圖利用軟件GraphPad Prism 6,計量資料數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差(±s)表示。 利用ANOVA 檢驗和t檢驗進行組間差異分析,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外周血細胞計數(shù)及分類性別差異比較

外周血細胞計數(shù)結果顯示,青年雌性大鼠白細胞計數(shù)(white blood cell,WBC)低于雄性(P>0.05),老年大鼠雌性比雄性低48.83%(P<0.01)。 老年組大鼠與青年組大鼠同性別之間比較有降低趨勢,但未見統(tǒng)計學差異。

紅細胞(red blood cell,RBC)計數(shù)結果青年組未見性別差異。 老年組雌性比雄性下降了9.38%(P<0.05)。 但與青年雄性組和青年雌性組相比,對應性別的老年組,均有明顯上升(P<0.01,P<0.05)。

外周血白細胞分類結果顯示,青年組和老年組中性粒細胞(neutrophilic granulocyte,NE)百分比未見性別差異。 但是相同性別中,老年組比青年組有明顯的升高,其中老年雄性組比青年雄性組上升了60.58%(P<0.01),老年雌性組比青年雌性組上升了23.81%(P<0.05)。

青年組和老年組淋巴細胞(lymphocyte,LY)百分比未見性別差異。 但是相同性別中,老年組比青年組有明顯的降低。 其中,老年雄性組比青年雄性組下降23.06%(P<0.01),老年雌性組比青年雌性組下降了14.26%(P<0.05)。

青年組及老年組嗜酸性粒細胞(eosinophilic granulocyte,EOS)百分比結果未見性別差異。 但是老年雄性和雌性大鼠對應青年雄性和雌性大鼠均有明顯上升,分別升高了88.16%和121.53%(P<0.05,P<0.01)。

老年組與青年組單核細胞(monocyte,MO)百分比比較未見差異,青年SD 大鼠未見性別差異,老年雄性大鼠MO 高于老年雌性大鼠95.83%,具有性別差異(P<0.05)。

血紅蛋白(hemoglobin,HGB) 濃度、血小板(platelet,PLT) 計數(shù)和嗜堿性粒細胞(basophilic granulocyte,BAS)百分比三項結果老年組與青年組比較、性別比較未見差異。 結果如表1 所示。

2.2 免疫臟器指數(shù)

青年大鼠胸腺指數(shù)未見性別差異。 老年雌性大鼠與老年雄性大鼠比較降低43.09%,具有性別差異(P<0.01)。 與青年雌性大鼠相比,老年雌性大鼠降低36.27%(P<0.01)。 提示老年雌性大鼠出現(xiàn)了胸腺指數(shù)下降。 青年SD 大鼠脾指數(shù)未見性別差異。 老年雄性組高于老年雌性組46.28%,有性別差異(P<0.01)。 和青年雄性組相比,老年雄性組上升了31.34%(P<0.01),提示老年雄性大鼠脾指數(shù)明顯上升。 結果如圖1 所示。

表1 老年大鼠與青年大鼠外周血細胞計數(shù)及分類性別差異比較Table 1 Sex difference of peripheral blood cell counts between aged and young rat

注:A:胸腺指數(shù);B:脾指數(shù)。 a:與青年雄性大鼠相比;b:與青年雌性大鼠相比;c:與老年雄性大鼠相比。圖1 老年大鼠與青年大鼠臟器指數(shù)性別差異比較Note.A, Thymus index.B, Spleen index.a, Compared with young male rat.b, Compared with young female rat.c, Compared with aged male rat.Figure 1 Sex difference of organ index between aged and young rat

2.3 外周血免疫細胞分型

流式分析外周血門的設置參考之前的研究[5]。外周血免疫細胞分型結果顯示,青年組大鼠各項指標未發(fā)現(xiàn)性別差異。

老年組輔助T 細胞(helper T cell,Th)未見性別差異。 相比于青年雌性大鼠,老年雌性大鼠Th 從(27.54 ± 3.34)% 上 升 到 (43.14 ± 6.51)% (P<0.01)。

老年雄性大鼠調(diào)節(jié)T 細胞(regulatory T cell,Treg)為(3.7±0.93)%,老年雌性大鼠 Treg 為(9.46±4.18)%,有性別差異(P<0.01)。 相比于青年雌性大鼠,老年雌性大鼠Treg 明顯升高,分別為(1.7±0.59)%及(9.46±4.18)%,具有明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.01)。

老年雄性大鼠細胞毒性 T 細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)比例為(7.79±2.26)%,與老年雌性大鼠(16.38±5.6)%比較,有性別差異(P<0.01)。 老年雄性大鼠較青年雄性大鼠,CTL 從(13.72±1.34)%下降到(7.79±2.26)%(P<0.05)。與青年雌性大鼠比較,老年雌性大鼠 CTL 則從(10.1±3.98)%上升到(16.38±5.6)%(P<0.05)。

老年雄性大鼠B 細胞為(36.48±8.09)%,老年雌性大鼠為(26.52±5.38)%,具有明顯性別差異(P<0.05)。 相比于青年雌性組,老年雌性大鼠B 細胞從(41.66±9.82)%下降到(26.52±5.38)%,具有明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.01)。

老年雄性大鼠自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)檢測結果為(7.61±3.33)%,老年雌性大鼠(4.82±1.72)%,有性別差異(P<0.05)。 相比于青年雄性組,老年雄性大鼠NK 從(3.97±0.56)%上升到(7.61±3.33)%(P<0.05)。 老年雌性組比青年雌性組有明顯的上升,但未見統(tǒng)計學差異。

單核細胞結果中各組大鼠結果分別為(0.19±0.18)%、(0.66±0.3)%、(1.02±0.71)%和(1.00±0.64)%,未見統(tǒng)計學差異。 結果見圖2。

2.4 脾免疫細胞分型

老年雄性大鼠脾單個核細胞 CD3 結果為(35.55±6.28)%,老年雌性大鼠(42.81±4.29)%,具有性別差異(P<0.05)。 與青年雌性大鼠相比,老年雌性大鼠從(33.72±3.51)%上升到(42.81±4.29)%(P<0.05);青年雄性大鼠與老年雄性大鼠鼠CD3 結果分別為(37.7±3.54)%和(35.55±6.28)%,未見統(tǒng)計學差異。

CD45RA 結果中各組結果分別為(44.32 ±2.12)%、 (48.52 ± 3.79)%、 (41.3 ± 4.83)% 和(36.08±5.08)%。 相比于青年雌性組,老年雌性組從(48.52±3.79)%下降到(36.08±5.08)%(P<0.01),雌性具有年齡差異。 結果見圖3。

2.5 脾T 細胞P16 mRNA 表達量檢測

分離大鼠脾T 淋巴細胞,檢測P16mRNA 表達量,以 2-ΔΔCt表示。 結果顯示,相比于青年大鼠,老年大鼠上升了272.05%(P<0.01),結果見圖4。 相比于青年雄性大鼠,老年雄性大鼠上升了232.72%,(P<0.01),老年雌性大鼠比青年雌性大鼠上升了307.57%(P<0.01)。 青年組大鼠及老年組大鼠的P16mRNA 均未見性別差異。

3 討論

本文進行了青年、老年大鼠外周血計數(shù)及白細胞分類、免疫細胞分型、免疫臟器指數(shù)及脾細胞免疫細胞分型、脾T 細胞p16 表達水平的檢測和性別差異比較分析。 青年大鼠各項指標檢測結果未見性別差異。

外周血計數(shù)及分類結果顯示,老年大鼠表現(xiàn)為WBC 下降,NE%升高,LY%降低,EOS%升高等老齡化改變。 其中WBC 出現(xiàn)性別差異,表現(xiàn)為雌性大鼠WBC 下降更為明顯。 在健康老年人群中女性WBC 低于男性[10-11]。 老年大鼠的肥胖可能也是引起WBC 性別差異的誘因之一,在代謝綜合征研究中,體重、腰圍等指標與WBC 呈明顯正相關[12]。 相比于老年雌性大鼠,老年雄性大鼠的體重上升,腹部脂肪增加可能與WBC 高于雌性有關。 老年雄性大鼠的中性粒百分比上升,淋巴百分比下降,發(fā)生髓系分化偏移,這是造血系統(tǒng)出現(xiàn)衰老和易發(fā)急性髓系白血病的血液學特征[13]。 本文中主要體現(xiàn)為老年雄性大鼠中性粒升高,與老年男性更易患髓系白血病相契合[14]。 與之前未發(fā)表的老年C57 小鼠結果進行進行對比發(fā)現(xiàn),EOS%的升高屬于老年性改變,暗示著老年人造血系統(tǒng)的紊亂和高發(fā)濕疹皮炎等相吻合[15-17]。

注:A:調(diào)節(jié)T 細胞;B:輔助T 細胞;C:細胞毒性T 細胞;D:B 細胞;E:自然殺傷細胞;F:單核細胞。 a:與青年雄性大鼠相比;b:與青年雌性大鼠相比;c:與老年雄性大鼠相比。圖2 老年大鼠與青年大鼠外周血免疫細胞分型性別差異比較Note.A, Helper T cells.B,Regulatory T cells.C,Cytotoxic T cell.D,B cell.E,Natural killer cell.F,Monocyte.a,Compared with young male rat.b, Compared with young female rat.c, Compared with aged male rat.Figure 2 Sex difference of peripheral blood immune cell typing between aged and young rat

注:A:CD3+;B:CD45RA+。 b:與青年雌性大鼠相比;c:與老年雄性大鼠相比。圖3 老年大鼠與青年大鼠脾免疫細胞分型性別差異比較Note.A, CD3+.B, CD45RA+.b, Compared with young female rat.c, Compared with aged male rat.Figure 3 Sex difference of spleen immune cell typing between aged and young rat

注:與青年大鼠相比,??P<0.01。圖4 老年大鼠和青年大鼠脾T 細胞的P16 mRNA 表達比較Note.Compared with young male rat, ??P<0.01.Figure 4 Comparison of P16 mRNA expression in splenic T cells between aged female rat and young female rat

免疫細胞分型結果顯示,老年大鼠T 細胞比例升高,B 細胞降低。 外周血與脾免疫細胞分型變化趨勢一致。 外周血T 細胞分型檢測結果顯示,老年大鼠CD4 升高,數(shù)據(jù)顯示主要是老年雌性升高所致,但未見性別差異。 老年大鼠CD8、Treg 升高,也是以雌性升高為主,具有性別差異。 雌性激素對Th1 細胞具有抑制作用,對Th2 具有刺激作用;老年雌性大鼠雌性激素水平降低,對Th1 和Th2 的調(diào)節(jié)作用發(fā)生變化,表現(xiàn)為T 細胞比例升高和B 細胞比例下降[18-20]。 調(diào)節(jié)性T 細胞的上升主要是隨著時間的積累而增加,但是雌激素的下降會導致雌性大鼠體內(nèi)受雌激素激活的T 細胞失去功能[21];所以在老年狀態(tài),有些細胞數(shù)量增加但功能會減退[22-23]。也有研究認為老年雌性大鼠T 細胞升高和老年女性對疫苗的免疫效力要高于老年男性,同時發(fā)生不良反應概率高相吻合[21]。

先天免疫細胞分型結果顯示老年大鼠NK 細胞比例升高,雄性高于雌性,有性別差異;老年大鼠單核細胞比例升高,未見性別差異。 在朱麗華的研究中顯示,健康中國成年人,大齡組的NK 細胞百分比和絕對值有性別差異,其他各項指標無差異[24]。 與大鼠的NK 和單核細胞比例變化結果一致。

脾T 細胞的p16INK4a 基因表達代表大鼠整個機體的衰老水平。 我們之前的研究中發(fā)現(xiàn),雄性大鼠P16 mRNA 表達水平與衰老程度成正相關[5]。本文檢測了雌性大鼠P16 的表達情況。 相比于青年雌性大鼠,老年雌性大鼠P16 mRNA 表達量明顯升高。 但老年組內(nèi)未見性別差異。 說明大鼠中P16mRNA 的表達升高主要與增齡有關,與Liu 等[25]和Melk 等[26]的結論一致。

上述結果顯示,老年大鼠出現(xiàn)外周血NE%升高、LY%降低、EOS%升高、脾T 細胞P16 升高等老齡化改變,未見性別差異,提示這些改變主要與增齡有關。 老齡化改變中,WBC,T 細胞和B 細胞這三項,老年雌性大鼠變化更為顯著。 青年組大鼠未見明顯性別差異,隨著月齡的增加和激素的變化,破壞了老年大鼠的免疫系統(tǒng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)(homeostasis)平衡[22,27],尤其是處于圍絕經(jīng)期的雌性大鼠,雌激素下降,周期紊亂[28],導致免疫系統(tǒng)衰老的進程中出現(xiàn)性別差異。 在今后的老年化研究中,若采用單一性別動物要注意研究結果可能會與實際情況存在偏差。