莫國艷韓祥志穆丹丹董雨薇韓林濤?黃 芳尹 強?

(1.湖北中醫(yī)藥大學,武漢 430065; 2.新疆維吾爾藥業(yè)有限責任公司,烏魯木齊 830026)

血虛癥指血液虧虛,形體失養(yǎng),以面色淡白,唇舌色淡,心悸多夢,手足發(fā)麻,等為常見證候。 與西醫(yī)中的紅細胞生成減少性貧血,失血性貧血,紅細胞破壞過多性貧血等疾病相對應。 鐵是形成血紅素的必需元素,血紅素是合成血紅蛋白的原料,含鐵元素蔗糖溶液或復方硫酸亞鐵葉酸片對貧血,尤其是對婦女妊娠期或產(chǎn)后貧血有良好的恢復作用[1-2]。 復方阿膠漿是一種純中藥制劑,有氣血雙補的功效,臨床上主要應用于治療各種貧血、經(jīng)期保健等[3-4]。 石榴補血糖漿以石榴為其主要組成成分,具有補氣血的作用,可用于治療氣血虧虛所致的心悸、氣短、頭暈、貧血、健忘等癥。 本研究所用石榴補血糖漿是經(jīng)國家藥監(jiān)局批準,由新疆維吾爾藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)。 石榴補血糖漿以酸石榴和甜石榴為主要原料,性味酸、甘,是補血、生血良藥。 酸石榴:血液質(zhì)調(diào)節(jié)藥,降低肝之熱,清心安神。 甜石榴:補心藥,功能生濕生寒,清熱補心,補肝壯陽。 實驗中用復方阿膠漿和硫酸亞鐵作為對照,采用灌胃的方法,來探討石榴補血糖漿對血虛證模型大鼠造血功能的影響及其相關機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級 4 周齡 Wistar 雄性大鼠 35 只,體重 160～200 g,來源于湖北省疾控中心[SCXK(鄂)2017-0012]。 無菌手術在武漢華聯(lián)科生物技術有限公司動物實驗中心屏障動物實驗設施進行[SYXK(鄂)2018-0104]。 實驗經(jīng)過武漢華聯(lián)科生物技術有限公司動物實驗中心倫理委員會批準(HLK -20181211-01),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

復方阿膠漿購自東阿阿膠股份有限公司,國藥準字Z20083345,批號:1708005;硫酸亞鐵購自阿拉丁公司,CAS 號:7782-63-0,批號:lot.#E1815087;石榴補血糖漿購自新疆維吾爾藥業(yè)有限責任公司,國藥準字Z20026094,批號:0180411;EPO ELISA 檢測試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司,貨號:MU30110;兔抗 SCF 抗體、兔抗 GM-CSF 抗體、兔抗GAPDH 抗體、羊抗兔二抗IgG 購自Thermo 公司,貨號分別為:26582-1-AP、PAB34381、PAB36264、PAB160011;BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自bioswamp 公司(貨號:PAB180007);SYBR Green PCR 試 劑 盒 購 自 KAPA Biosystems 公 司, 貨號:KM4101。

酶標儀:芬蘭(Labsystems Multiskan MS)公司產(chǎn)品,型號:352 型;全自動化學發(fā)光分析儀:上海天能科技有限公司,型號:Tanon-5200;全自動血液分析儀:美國 MASCOT 公司,型號:HEMAVET 950;熒光定量 PCR 儀: 美國 Bio-Rad 公司, 型號: CFXConnect 96。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物建模

將大鼠隨機分為7 組,1 個對照組和6 個實驗組。 對照組喂食普通飼料,實驗組喂食低鐵飼料,喂食4 周,并輔以少量尾靜脈放血(每周放血一次,每次1～1.5 mL)建立缺鐵性貧血模型。 6 個實驗組分為模型組、石榴補血糖漿低劑量組3.125 mL/(kg·d)、中劑量組 9.375 mL/(kg·d)、高劑量組 28.125 mL/(kg·d)、復方阿膠漿組6.25 mL/(kg·d)、硫酸亞鐵組0.27 mL/(kg·d),給藥周期為20 d,每天灌胃給藥,每10 d采集大鼠全血一次,用于血象指標的檢測。 給藥結(jié)束時,采血分離血清,并采集兩側(cè)脛骨。

1.3.2 外周血象分析

在給藥的第 0、10、20 天,采血測定血象指標:紅細胞數(shù)目、白細胞計數(shù),血小板計數(shù),血紅蛋白濃度以及紅細胞比容。

1.3.3 大鼠骨髓有核細胞分離

依據(jù)鄢星等[5]方法,取小鼠雙側(cè)股骨,剪開股骨暴露出骨髓腔,用2 mL 培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,收集細胞。

1.3.4 ELISA 檢測促紅細胞生成素(EPO)

96 孔板每孔加血清40 μL,加生物素標記的EPO 抗體10 μL,混勻,再加辣根過氧化物酶結(jié)合物,37℃孵育30 min,洗滌5 次,每孔分別加顯色液A 和顯色液 B 各 50 μL,混勻,37℃孵育 10 min,每孔加終止液50 μL,在酶標儀450 nm 處讀數(shù)。

1.3.5 Real-time PCR 檢測骨髓有核細胞SCF、GMCSF 核酸表達

提取骨髓有核細胞內(nèi)RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再進行 Real-time PCR 擴增,擴增體系如下:SYBR Green Mix 10 μL,上、下游引物 0.5 μL,cDNA 模板 1 μL,ddH2O 8 μL,總體積 20 μL。 反應程序:95℃,3 min;95℃,5 s;56℃,10 s;72℃,25 s;39 cycles;65℃,5 s;95℃,50 s。 以 GAPDH 作為內(nèi)參,結(jié)果采用 2-△△Ct法進行分析。 引物序列見表1。

1.3.6 Western blot 檢測骨髓有核細胞 SCF、GMCSF 蛋白表達

將細胞裂解,離心后取上清進行蛋白質(zhì)濃度測定。 然后用12%的分離膠,5%的濃縮膠進行蛋白質(zhì)電泳、90 V 轉(zhuǎn)膜50 min、5%脫脂奶粉封閉2 h、孵育兔抗大鼠 SCF 抗體(1 ∶1000 稀釋)、兔抗大鼠 GMCSF 抗體(1 ∶2000 稀釋)、兔抗大鼠 GAPDH 抗體(1∶2000 稀釋),37℃孵育 2 h,洗滌 3 次,加羊抗兔二抗 IgG(1 ∶20000 稀釋)37℃ 孵育 1 h,洗滌 3 次,暗室中與ECL 發(fā)光液充分接觸,于全自動化學發(fā)光分析儀中檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析,結(jié)果采用平均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。 使用Graphpad prism 6 軟件制作統(tǒng)計圖。

表1 Real-time PCR 檢測引物序列Table 1 Real-time PCR Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 石榴補血糖漿對大鼠存活率的影響

飼喂低鐵飼料4 周后,大鼠出現(xiàn)精神萎靡,可視粘膜蒼白癥狀。 存活率情況見圖1。 在連續(xù)給藥20 d 后,石榴補血糖漿高、中、低組、硫酸亞鐵組和復方阿膠漿組,臨床癥狀消失。 模型組在連續(xù)觀察期的第2、3、4 天各有一只大鼠死亡;石榴補血糖漿高劑量組在第7 天死亡一只;中劑量組在第5 天死亡一只;低劑量組在第4、5 天各死亡一只;硫酸亞鐵組在第3、5 天各死亡一只;復方阿膠漿組在第5 天死亡一只。

2.2 石榴補血糖漿對大鼠血象的影響

石榴補血糖對大鼠的血象的影響情況見圖2。紅細胞數(shù)量顯示在第10 天,與模型組比較,對照組、石榴補血糖漿高、中、低劑量組均有顯著性差異(P<0.05 或P<0.01);在第20 天,與模型組比較,對照組、石榴補血糖漿高、中、低劑量組均有顯著性差異(P<0.05 或P<0.01)。 血紅蛋白含量與紅細胞比容和紅細胞變化趨勢基本相同。 在第10 天和第20天,與模型組比較,對照組、石榴補血高、中、低劑量組組血小板及白細胞數(shù)量均明顯增多(P<0.05或P<0.01)。

2.3 石榴補血糖漿對EPO 含量的影響

第20 天,模型組EPO 含量有明顯的上升,而其它組均有一定的降低,其中模型組和對照組、石榴補血糖漿高劑量組有顯著性差異(P<0.05)。 詳見圖3。

注:不同顏色代表不同組小鼠存活率。圖1 藥物使用后大鼠存活率(n=5)Note.Different colors represent the survival rate of different groups of mice.Figure 1 Rat survival rate after drug use

注:圖中各組bar 依次代表分別給藥處理10 d 和20 d 后的血象指標。 與模型組比較,?P<0.05,??P<0.01。圖2 不同給藥時間點血常規(guī)結(jié)果(n=5)Note.The each group of bar in the figure represents the blood indicators after 10 and 20 days of treatment respectively.Compared with model group, ?P<0.05, ??P<0.01.Figure 2 Blood routine results at different time points

2.4 石榴補血糖漿對骨髓有核細胞數(shù)的影響

根據(jù)血象分析和動物的體征,中劑量組的效果較好,且接近半數(shù)有效量(ED50),后續(xù)實驗選擇了中劑量。 與模型組比較,對照組、中劑量組、硫酸亞鐵組、復方阿膠漿組有核細胞數(shù)量均顯著增多(P<0.01)。 詳見圖4。

2.5 石榴補血糖漿對骨髓有核細胞中SCF、GMCSF 的核酸表達的影響

在骨髓有核細胞中,中劑量組、硫酸亞鐵組、復方阿膠漿組SCF 基因表達量均有所上升(P<0.05或P<0.01)。 GM-CSF 基因表達量也呈現(xiàn)相似趨勢,中劑量組、硫酸亞鐵組、復方阿膠漿組GM-CSF基因表達量均有所上升,其中,模型組與對照組有較顯著差異(P<0.01),模型組與中劑量組和硫酸亞鐵組有顯著性差異(P<0.05)。 詳見圖5。

2.6 石榴補血糖漿對骨髓有核細胞中SCF、GMCSF 的蛋白表達水平的影響

與模型組相比,對照組、中劑量組、硫酸亞鐵組、復方阿膠漿組骨髓有核細胞內(nèi)SCF、GM-CSF 的表達水平明顯升高。 中劑量組與模型組有較顯著性差異(P<0.01),且模型組與對照組也有較顯著差異(P<0.01)。 詳見圖6。

3 討論

治療血虛證,常用藥物有阿膠,黃芪,石榴,復方硫酸亞鐵葉酸片等。 本研究用硫酸亞鐵和復方阿膠漿作為對照,來探究石榴補血糖漿對血虛癥的作用,結(jié)果顯示,石榴補血糖漿組大鼠存活率有所升高,且死亡時間比模型組靠后,說明石榴補血糖漿能降低大鼠血虛證死亡率。 在用石榴補血糖漿高、中劑量的第10 天和第20 天,紅細胞數(shù)量和模型組相比有顯著性增高(P<0.01),另外對血小板的恢復作用也相當明顯,這說明石榴補血糖漿有良好的補血效果,能有效地緩解大鼠的血虛癥狀,這與李學強等[6]人研究結(jié)果一致。 在第20 天,石榴補血糖漿組白細胞數(shù)量和模型組相比有顯著性增高,這表明石榴補血糖漿能較好地恢復大鼠白細胞數(shù)量,有一定的增強免疫的功能。

機體在缺血的情況下,會快速啟動骨髓的造血功能,組織學上表現(xiàn)為血細胞前體細胞(幼稚紅細胞、多核聚細胞)增多[6-8],在本研究中,石榴補血糖漿組骨髓內(nèi)有核細胞數(shù)有明顯的升高,這表明石榴補血糖漿在機體外周血細胞降低的情況下,能有效地促進骨髓造血。 促紅細胞生成素EPO,生理功能主要是與紅系祖細胞的表面受體結(jié)合,促進骨髓內(nèi)紅系定向干細胞分化為紅系母細胞、骨髓內(nèi)網(wǎng)織紅細胞和紅細胞的釋放。 在機體外周血缺少紅細胞的情況下,機體會通過負反饋調(diào)節(jié)機制,來促進機體合成更多的EPO,EPO 作用于骨髓紅系祖細胞,進而產(chǎn)生更多的紅細胞[9-10]。 鄧家剛等[11]人發(fā)現(xiàn),雞血藤總黃酮可以通過提高血清中EPO 的含量,從而緩解因各種化學因素所致的血虛癥狀。 在本研究中,模型組紅細胞含量明顯低于對照組,且模型組EPO 含量有明顯的上升,并和石榴補血糖漿高劑量組有顯著性差異,這說明高劑量石榴補血糖漿可能通過調(diào)節(jié)EPO 含量,進而提高大鼠紅細胞數(shù)量。

注:圖中各組bar 依次代表分別給藥處理20 d 后的EPO 的含量。 與模型組比較,?P<0.05。圖3 第20 天血清中EPO 含量(n=5)Note.The each group of bar in the figure represents the EPO content in serum on 20th day.Compared with model group,?P <0.05.Figure 3 EPO content in serum on 20th day

注:圖中各組bar 依次代表分別給藥處理20 d 后的骨髓有核細胞數(shù)。 與模型組比較,??P<0.01。圖4 第20 天骨髓有核細胞數(shù)(n=5)Note.The each group of bar in the figure represents the number of bone marrow nucleated cells on 20th day.Compared with model group,??P <0.01.Figure 4 Number of bone marrow nucleated cells on 20th day

注:圖中各組bar 依次代表分別給藥處理20 d 后的骨髓有核細胞中SCF、GM-CSF mRNA 表達。 A:SCF mRNA 相對表達量;B:GM-CSF mRNA 相對表達量。 與模型組比較,?P<0.05,??P<0.01。圖5 骨髓有核細胞中SCF、GM-CSF mRNA 表達(n=5)Note.The each group of bar in the figure represents expression of SCF and GM-CSF mRNA in bone marrow nucleated cells.A, Relative expression of SCF mRNA.B, Relative expression of GM-CSF mRNA.Compared with model group,? P <0.05, ?? P <0.01.Figure 5 Expression of SCF and GM-CSF mRNA in bone marrow nucleated cells

注:圖中各組bar 依次代表分別給藥處理20 d 后的骨髓有核細胞中SCF、GM-CSF 蛋白表達。 A:1:對照組;2:中劑量組;3:模型組;4:硫酸亞鐵組;5:復方阿膠漿組;B:SCF 蛋白相對表達量;C:GM-CSF 蛋白相對表達量。 與模型組比較,??P<0.01。圖6 骨髓有核細胞中SCF、GM-CSF 蛋白表達(n=5)Note.The each group of bar in the figure represents expression of SCF and GM-CSF protein in bone marrow nucleated cells.A, 1, Control group.2, Medium dose group.3, Model group.4, Ferrous sulfate group.5, Compound donkey-hide gelatin group.B, Relative expression of SCF protein.C, Relative expression of GM-CSF protein.Compared with model group,??P <0.01.Figure 6 Expression of SCF and GM-CSF protein in bone marrow nucleated cells

SCF、GM-CSF 對髓系干細胞到成熟粒細胞的增殖與分化過程均有刺激作用。 叢培瑋等[12]發(fā)現(xiàn)脾氣虛證大鼠模型的外周血象中,紅細胞數(shù)及SCF 含量均出現(xiàn)明顯降低。 王琰等[13]對35 例慢性再生障礙性貧血患者骨髓樣本進行分析后發(fā)現(xiàn),患者體內(nèi)的SCF 水平明顯低于正常人。 姚楠等人[14]用加味當歸補血湯對血虛證大鼠進行干預后,發(fā)現(xiàn)血虛大鼠的EPO 和GM-CSF 的表達量均出現(xiàn)不同程度的升高,紅細胞和血紅蛋白數(shù)量明顯增加。 因此,EPO,SCF,GM-CSF 均可正向調(diào)控造血,表達量減少,則會出現(xiàn)造血調(diào)節(jié)因子不能充分促進骨髓造血而導致貧血,而表達增加則促進骨髓造血,進而增加血細胞生成,增加血管中的血容量[15-20]。 本研究中,石榴補血糖漿組和模型組相比,SCF、GM-CSF 表達量均有明顯升高,這表明石榴補血糖漿能增加大鼠SCF、GM-CSF 表達量,進而促進骨髓造血,產(chǎn)生大量的血細胞,用于恢復外周血細胞數(shù)量,這也可能是石榴補血糖漿恢復機體血細胞水平的主要機制之一。

綜上所述,石榴補血糖漿可緩解血虛癥的臨床癥狀,增加血細胞數(shù)量和紅細胞比容,促進造血功能相關的細胞因子EPO,SCF,GM-CSF 的表達,且可以提高骨髓有核細胞數(shù)量,提示石榴補血糖漿可能通過提高造血細胞因子EPO,SCF,GM-CSF 的表達量來改善血虛證模型大鼠的造血功能。