徐 濤顧 鵬陳傍柱葉 行梁春錦張映輝顧為望

(1.南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心暨比較醫(yī)學(xué)研究所,廣州 510515; 2.東莞松山湖明珠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司,廣東東莞 523808; 3.五邑大學(xué)生物科技與大健康學(xué)院,廣東江門 529020)

高遷移率蛋白A2(high-mobility group AT-hook 2,HMGA2)屬于高遷移率蛋白超家族成員,是一種非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白,主要包括三個(gè)AT-hook區(qū)以及一個(gè)酸性C 末端[1]。 AT-hook 區(qū)可以高親和力的結(jié)合到基因組中AT 富集區(qū)域,這些區(qū)域一般都是相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控元件,從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。HMGA2 基因位于12 號(hào)染色體長(zhǎng)臂,由5 個(gè)外顯子構(gòu)成。 HMGA2 一般在胚胎發(fā)育早期以及未分化的細(xì)胞中高表達(dá),而在成體正常細(xì)胞或高度分化的細(xì)胞中基本不表達(dá)或表達(dá)量很低[2]。 但是,研究發(fā)現(xiàn)在肺癌[3]、乳腺癌[4]、胃癌[5]、結(jié)直腸癌[6]等腫瘤組織中HMGA2 的表達(dá)均顯著升高,提示HMGA2可能是一個(gè)致癌基因,可以作為癌癥早期診斷的潛在分子靶標(biāo)[7]。 HMGA2 的異常表達(dá)通常與腫瘤發(fā)生相關(guān),它主要影響腫瘤細(xì)胞的增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、轉(zhuǎn)移以及腫瘤組織內(nèi)的微血管生成等過程[8-9]。

肝癌作為一種常見腫瘤,其發(fā)病率與致死率均在各種腫瘤中名列前茅,而且肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性強(qiáng)[10]、對(duì)常規(guī)化療藥物耐受性較強(qiáng)[11]、預(yù)后較差等特點(diǎn)進(jìn)一步加劇了治療難度。 因此,篩選肝癌治療的潛在分子靶點(diǎn),對(duì)于肝癌的早期診斷、臨床治療以及預(yù)后評(píng)估具有重大意義[12]。 雖然 HMGA2 已證明在多種腫瘤中均可作為分子靶標(biāo)以及預(yù)后評(píng)估的潛在分子,但HMGA2 在肝癌中的作用目前研究較少。 本研究采用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)引起肝癌細(xì)胞系HepG2 中的HMGA2 基因大片段刪除,進(jìn)而失活該基因,建立HMGA2 敲除細(xì)胞株,并對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)功能的鑒定,探討HMGA2 對(duì)于肝癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響,從而為肝癌的靶向治療提供一定的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞系HepG2 購(gòu)自美國(guó)ATCC。

1.2 主要試劑

PX458 質(zhì) 粒 購(gòu) 自 Addgene; 高 糖 DMEM(8115247)、胎牛血清(42A0378 K)、雙抗(21442)、0.25%胰蛋白酶(25200)購(gòu)自Gibco;Lipofectamine?2000(2004957)、 Opti-MEM ? (1119701)、 TRIzol(15596026 ) 購(gòu)自 Thermo; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AI40826A)、熒光定量 PCR 試劑盒(AJ51622A)、細(xì)胞基因組提取試劑盒(AK2101)、Premix TaqTM酶(A191625A)、T4 連接酶(AH70103A)購(gòu)自 TaKaRa;DH5α 感受態(tài)細(xì)胞(180428)與質(zhì)粒小提試劑盒(S7923)購(gòu)自TIANGEN;Bbs Ⅰ內(nèi)切酶(00397116)、T4 PNK 磷酸化酶(10020296)購(gòu)自NEB;Transwell小 室 (11919023)、 Matrigel 膠 (9119018) 購(gòu) 自Corning;全蛋白提取試劑盒(20190213)購(gòu)自凱基生物;HMGA2 一抗(79h6360) 及 Western blot 二抗( 12v9698 ) 購(gòu) 自 Affinity、 GAPDH 一 抗( AH08191878 ) 購(gòu) 自 Bioss; CCK8 試 劑 盒(EG20180126)購(gòu)自南京恩晶生物。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% FBS、1%青/鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基中,于37℃、5% CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng),每隔3 d 換一次液。 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 sgRNA 寡核苷酸鏈設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank 中發(fā)表的HMGA2 序列信息(ID:NM_003483),利用CRISPR/Cas9 sgRNA 在線設(shè)計(jì)軟件(http:/ /crispor.tefor.net/)分別在HMGA2 基因的第一外顯子與第二外顯子處各設(shè)計(jì)一條sgRNA,分別命名為sgE1 與sgE2(如圖1),并在正義鏈的5′端添加CACC 接頭,在反義鏈的5′端添加AAAC 接頭,便于與酶切載體連接;此外,由于sgE2 不是以G開頭,所以需在接頭與sgE2 的5′端之間加上G,以提高U6 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。 最終oligo 序列如表1所示。

1.3.3 重組載體PX458-sgRNA 構(gòu)建

兩條sgRNA 進(jìn)行末端磷酸化與退火反應(yīng),反應(yīng)體系為:sgRNA-T 1 μL,sgRNA-B 1 μL,T4 PNK 0.5 μL,T4 Ligase Buffer 1 μL,ddH2O 6.5 μL,37℃反應(yīng)30 min 后于沸水中加熱5 min,自然冷卻至室溫。 用T4 連接酶將退火產(chǎn)物與經(jīng)Bbs I 酶切的PX458 質(zhì)粒連接,16℃連接30 min,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5ɑ 中,均勻涂布于含氨芐青霉素的LB 固體平板上37℃過夜培養(yǎng),挑取單克隆鑒定并由睿博興科廣州分公司采用Sanger 測(cè)序法進(jìn)一步鑒定正確插入。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與單克隆篩選

將狀態(tài)良好的細(xì)胞鋪到24 孔板中,待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)采用Lipo2000 將兩個(gè)sgRNA 重組質(zhì)?；旌限D(zhuǎn)染HepG2 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染2 d 后于熒光顯微鏡下觀測(cè)轉(zhuǎn)染效率。 將細(xì)胞懸液稀釋至每毫升100 個(gè)細(xì)胞,以每孔10 μL 加入96 孔板,進(jìn)行單克隆篩選,待克隆長(zhǎng)至合適大小后挑取克隆于24 孔板中,并進(jìn)行敲除鑒定。

1.3.5 細(xì)胞敲除株鑒定

采用NP40 裂解細(xì)胞,程序?yàn)?56℃ 1 h,95℃ 10 min。 擴(kuò)增HMGA2 基因敲除后的短序列片段,PCR引 物 序 列 為:HMGA2-F: 5′-GACGTCCGGTGTTG ATGGTG-3′,HMGA2-R: 5′-CAAATTCCTGGCTGCG GAGT-3′,擴(kuò)增程序?yàn)?95℃ 3 min;94℃ 30 s,60℃30 s,72℃ 30 s,36 個(gè)循環(huán);72℃ 2 min。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并送睿博興科廣州分公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序。 對(duì)經(jīng)測(cè)序鑒定為可能Indel 的片段采用 pMD19-T Vector Cloning Kit 進(jìn)行 TA 克隆,隨機(jī)挑取10 個(gè)單克隆進(jìn)行Sanger 測(cè)序,并通過BLAST 在線軟件比對(duì),鑒定敲除株基因型。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用TRIzol 法提取RNA,并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用嵌合熒光法對(duì)HMGA2的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析,以GAPDH為內(nèi)參。qPCR 反應(yīng)條件為:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);60℃ 2 min。 采用 2-ΔΔCt法分析基因相對(duì)表達(dá)情況。 所用引物如表2 所示。

1.3.7 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

將對(duì)照組與敲除株細(xì)胞鋪于六孔板,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯合度時(shí),用冷的PBS 洗兩遍,加入200 μL細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min。 4℃,12000 r/min離心5 min。 吸取上清,用BCA 法進(jìn)行蛋白定量,并用5×Loading buffer 調(diào)整蛋白至適當(dāng)濃度,100℃水浴 5 min。 SDS-PAGE 電泳,恒壓 80 V 30 min,120 V 60 min,切下目的條帶與內(nèi)參條帶,轉(zhuǎn)PVDF 膜。 用5% BSA 室溫封閉1 h,一抗4℃過夜孵育,TBST 洗膜5 min×4 次,二抗室溫孵育1 h,TBST 洗膜5 min×4 次。 采用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.3.8 CCK8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

圖1 sgRNA 位點(diǎn)Figure 1 Locus of sgRNA

表1 sgRNA oligo 序列Table 1 Sequence of sgRNA oligo

表2 qPCR 引物Table 2 qPCR amplification primers

用0.25%胰酶消化細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液。 將細(xì)胞密度調(diào)整為每毫升1×104個(gè),每孔200 μL。 加入96 孔板中,每個(gè)樣品6 個(gè)重復(fù),置于 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 分別在 0 h,24 h,48 h,72 h 和96 h 每孔加入10 μL CCK8,37℃避光孵育4 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處吸光度。 用樣品吸光度減去空白吸光度得到相對(duì)吸光度值,采用Graphpad prism 5軟件繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.9 克隆形成實(shí)驗(yàn)

用0.25%胰酶消化細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,以1000 個(gè)/孔將細(xì)胞均勻鋪到六孔板中,每3 d 換一次液。 待長(zhǎng)出肉眼可見單克隆后,采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞,1%結(jié)晶紫溶液染色,計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)大于50的單克隆數(shù)量。

1.3.10 腫瘤遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)

用胰酶消化細(xì)胞后,將細(xì)胞移入離心管中,1000 r/min 離心5 min,PBS 洗兩遍并用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將細(xì)胞密度調(diào)整為每毫升5×105個(gè)。 對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn),每個(gè)Transwell 上室加入100 μL 細(xì)胞懸液,下室加入 600 μL 含 10% FBS 的全培,培養(yǎng)箱中孵育24 h;對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn),先以1 ∶8的比例于冰上采用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel 膠,每個(gè)Transwell 上室加70 μL 稀釋的 Matrigel 膠,培養(yǎng)箱中孵育6 h,待膠完全凝固后,下室加入600 μL 含10% FBS 的全培,培養(yǎng)箱中孵育30 min,向上室中輕柔加入200 μL 細(xì)胞懸液,培養(yǎng)箱中孵育24 h。 取出上室,PBS洗3 遍后用棉簽擦去上室孔內(nèi)的細(xì)胞與Matrigel膠,4%多聚甲醛固定15 min,結(jié)晶紫溶液染色10 min,在10×10 倍鏡下隨機(jī)選取十個(gè)視野,計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 24.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。 組間比較采用t檢驗(yàn),P< 0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PX458-sgRNA 載體鑒定

將兩對(duì)sgRNA oligo 退火形成雙鏈后連接到經(jīng)Bbs I 酶切的PX458 質(zhì)粒上,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌并挑取單克隆菌落,經(jīng)PCR 鑒定后將陽性質(zhì)粒測(cè)序。 測(cè)序結(jié)果顯示兩對(duì)sgRNA 均正確插入到酶切位點(diǎn)內(nèi)(圖2)。

2.2 細(xì)胞敲除株鑒定

將兩對(duì)PX458-sgRNA 載體混合轉(zhuǎn)染HepG2 細(xì)胞,采用有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞集落,用一對(duì)鑒定引物,采用短片段擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR 鑒定,敲除株由于大片段刪除可以得到400 bp 左右的片段(圖3A)。 將擴(kuò)增片段測(cè)序,結(jié)果顯示在 sgRNA 位點(diǎn)處存在套峰,即插入/缺失突變(圖3B)。 進(jìn)一步基因型分析顯示,敲除株的基因組存在大片段缺失(表3)。 對(duì)敲除株細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè),結(jié)果表明在mRNA 水平上HMGA2 的表達(dá)已有大幅度下降(P< 0.01,圖3C)。 Western blot 檢測(cè)顯示已經(jīng)完全沒有HMGA2 蛋白的表達(dá)(圖3D)。 綜合結(jié)果可知,獲得的細(xì)胞株為HMGA2-/-細(xì)胞株。

2.3 HMGA2 敲除引起細(xì)胞增殖速率的改變

采用CCK8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力以及克隆形成能力。 CCK8 實(shí)驗(yàn)表明,HMGA2 敲除后細(xì)胞的增殖速率明顯減慢(圖4A);而克隆形成實(shí)驗(yàn)也表明HMGA2 敲除引起克隆形成能力減弱,細(xì)胞存活率降低(121.83 ± 21.68 vs 59.50 ± 20.68,P< 0.01,圖4B)

2.4 HMGA2 敲除對(duì)于腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲的影響

Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)表明, 相對(duì)于野生型,HMGA2 敲除后 HepG2 的遷移能力明顯減弱(359.67 ± 32.53 vs 245.61 ± 24.23,P< 0.05)(圖5)。 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)也表明HMGA2 的敲除也會(huì)導(dǎo)致 HepG2 細(xì)胞體外侵襲能力減弱(251.33 ±43.43 vs 47.00 ± 10.00,P< 0.01)(圖5)。

圖2 PX458-sgRNA 載體測(cè)序結(jié)果Figure 2 Sequencing results of PX458-sgRNA vectors

注:A:PCR 鑒定大片段刪除(M:DL1000 marker);B:Sanger 測(cè)序顯示在sgRNA 位點(diǎn)處存在插入/缺失突變;C:RT-qPCR 檢測(cè)mRNA 表達(dá)水平;D:Western blot 檢測(cè)HMGA2 蛋白水平表達(dá)。 與對(duì)照組比較,??P < 0.01。圖3 細(xì)胞敲除株鑒定結(jié)果Note.A, Larger fragment deletion was tested by RCR (M, DL 1000 marker).B, Indel in sgRNA locus was investigated by Sanger sequencing.C, Expression levels were measured by RT-qPCR.D, Western blot to analyze HMGA2 protein upon knockout HMGA2.Compared with control group, ??P < 0.01.Figure 3 Identification of knockout cell line

表3 細(xì)胞株基因型Table 3 Genetypes of cell line

注:A:CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖速率;B:克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力。 與對(duì)照組比較,??P< 0.01。圖4 HMGA2 敲除對(duì)于細(xì)胞增殖的影響Note.A, Proliferation rates were evaluated via CCK8 trial.B, Ability of clone formation was investigated by clone formation assay.Compared with control, ??P < 0.01.Figure 4 Effect of proliferation in HMGA2 knockout

注:與對(duì)照組比較,?P < 0.05,??P < 0.01。圖5 HMGA2 敲除對(duì)于細(xì)胞遷移與侵襲的影響Note.Compared with control, ?P<0.05, ??P < 0.01.Figure 5 Effect of HMGA2 knockout on migration and invasion

3 討論

人類HMGA2 基因位于染色體12q15 區(qū)域,其編碼的蛋白屬于高遷移率蛋白家族成員,主要作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,通過蛋白-蛋白或者蛋白-DNA 互作調(diào)控靶基因的表達(dá)。 有研究表明,HMGA2 主要在胚胎早期以及腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),而在正常成體組織中則表達(dá)量很低或不表達(dá),提示HMGA2 對(duì)于胚胎早期的正常發(fā)育極為重要,同時(shí)也是一個(gè)重要的致瘤因子。 Yang 等[13]發(fā)現(xiàn)沉默HMGA2 抑制急性髓性白血病細(xì)胞的遷移、侵襲以及生存能力,增強(qiáng)其凋亡速率以及對(duì)藥物的敏感性。 同樣的,Zhu等[14]沉默鱗狀細(xì)胞癌中的HMGA2 也引起細(xì)胞中EMT 有關(guān)基因的下調(diào),而過表達(dá)則可使癌細(xì)胞獲得干細(xì)胞樣特征。 對(duì)胃癌的病例研究發(fā)現(xiàn),HMGA2有助于胃癌的血管生成,從而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng),此外還與腫瘤患者的預(yù)后不良有關(guān)[15]。 但是對(duì)自發(fā)性胰腺癌小鼠的研究發(fā)現(xiàn),HMGA2 敲除鼠與野生型鼠在胰腺癌的發(fā)生率、對(duì)藥物的敏感性以及預(yù)后等指標(biāo)上并沒有太大差別,表明HMGA2 作為胰腺癌的分子標(biāo)記以及預(yù)后標(biāo)志物還有待商榷[16]。 本研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞系HepG2 中敲除HMGA2 后細(xì)胞的遷移與侵襲能力顯著降低,表明HMGA2 也與肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲有關(guān)。 此外,通過對(duì)原發(fā)性肝癌的病例研究也發(fā)現(xiàn)HMGA2 陽性患者明顯預(yù)后不良[17],提示HMGA2 也可能作為評(píng)估肝癌預(yù)后的分子標(biāo)記。

HMGA2 除了與細(xì)胞的遷移、侵襲以及腫瘤預(yù)后有關(guān)外,還與腫瘤細(xì)胞的增殖與抗凋亡有關(guān)。 研究表明,在急性髓性白血病細(xì)胞中,HMGA2 主要通過PI3K/Akt/mTOR 通路促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,HMGA2 的敲除會(huì)引起細(xì)胞 G2/M 期阻滯[18]。 在膀胱癌中,HMGA2 抑制了 TGF-β/Smad 通路以及Wnt/β-catenin 通 路, 同 時(shí) 沉 默HMGA2 降 低 了MMP2 以及MMP9 的表達(dá)水平,提高了癌細(xì)胞的凋亡速率[9]。 與此類似,李鵬等[19]發(fā)現(xiàn)敲減HMGA2抑制了TGF-β1 誘導(dǎo)的人胚腎成纖維細(xì)胞的膠原合成,促進(jìn)了ROS 的產(chǎn)生。 ROS 的產(chǎn)生則會(huì)引發(fā)細(xì)胞的凋亡反應(yīng),有助于阻止癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。 Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn) HMGA2 的三個(gè) AT-hook 區(qū)可以與P53 結(jié)合,從而提高P53 泛素化水平,加快P53 蛋白的降解。 本研究通過CCK8 實(shí)驗(yàn)以及克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,HMGA2 敲除也同樣引起了HepG2 細(xì)胞的增殖速率以及克隆形成能力的顯著降低,但具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述,HMGA2 在多種腫瘤中均發(fā)揮了促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,增強(qiáng)遷移與侵襲能力以及降低細(xì)胞凋亡速率等作用。 與此類似,本研究發(fā)現(xiàn)HMGA2在肝癌細(xì)胞 HepG2 中也發(fā)揮相似的功能,敲除HMGA2 顯著抑制了HepG2 細(xì)胞的增殖速率、克隆形成能力、遷移與侵襲能力,表明HMGA2 也可能作為一個(gè)肝癌治療的潛在分子靶標(biāo)。