張少華張彥芳曹 萌李 燕廖立夏王貝貝

(1.南陽市第一人民醫(yī)院兒一科,河南南陽 473000; 2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌二病區(qū),河南新鄉(xiāng) 453100)

丙泊酚因其起效快,連續(xù)輸注而無累積和恢復(fù)快等特點(diǎn),已在兒科和產(chǎn)科患者中普遍用作靜脈麻醉藥和鎮(zhèn)靜藥[1]。 胎兒和新生兒應(yīng)用丙泊酚可引起短期和長期神經(jīng)毒性,導(dǎo)致神經(jīng)變性[2]。丙泊酚會引起劑量依賴的變化,導(dǎo)致新生神經(jīng)元和胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的損傷,并對嚙齒動物造成永久性的神經(jīng)損傷[3-4]。 丙泊酚對嬰兒大腦發(fā)育的潛在副作用也引起了人們對其安全性的關(guān)注,因此開發(fā)新的藥物來預(yù)防丙泊酚的神經(jīng)元副作用具有重要意義。

胍基丁胺(agmatine)是L-精氨酸在精氨酸脫羧酶作用下的產(chǎn)物,分布于哺乳動物體內(nèi)所有器官和組織,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可作為抗抑郁藥物,促進(jìn)記憶的鞏固[5],具有抑制肝癌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞增殖的作用[6]。 相關(guān)研究表明,胍基丁胺可在OGD 模型中明顯減少神經(jīng)元死亡,保護(hù)缺血神經(jīng)元,并減少NCAO 模型腦梗死面積[7]。 目前未見關(guān)于胍基丁胺對丙泊酚誘導(dǎo)的新生大鼠的神經(jīng)毒性具體作用機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。 本文旨在探討胍基丁胺對丙泊酚誘導(dǎo)的新生大鼠的神經(jīng)毒性的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

60 只無特定病原級 (specefic pathogen free,SPF) 健康雄性SD 大鼠,來源于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司[SCXK(川)2019-031],3 周齡,體重(50±3)g,飼養(yǎng)于河南省精神病醫(yī)院[SYXK(豫)2020-0010]。 常規(guī)飼養(yǎng)7 d。 本文研究均經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)(IACUC-20191012-11),符合3R 原則。

1.2 主要試劑

胍基丁胺(S98238)購自上海源葉生物科技有限公司,化學(xué)式:C5H14N4,分子量:130.19,純度≥97%;丙泊酚(100806-201803)購自中國食品藥品檢定研究院,化學(xué)式:C12H18O,分子量:178.27,純度≥99.9%;TTC 染液(D025-1-3)、蘇木素-伊紅染液(D006-1-1)購自南京建成生物工程研究所;Nissl 染色液(C0117)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(A0208)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所;兔抗 BDNF ( ab226843 )、 NGF ( ab6199 )、 Bax(ab53154)、Bcl-2(ab196495)、Nrf2(ab31163)、p-Nrf2(ab137550)、HO-1(ab13243)單克隆抗體購自英國Abcam 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物模型建立及分組

將大鼠隨機(jī)分為 5 組:Control 組、Propofol 組、Propofol + Agmatine 1.25 mg/kg 組、 Propofol +Agmatine 2.5 mg/kg 組和 Propofol+Agmatine 5 mg/kg 組。 參照 Xiao 等[8]方法對除 Control 組外各組腹腔注射丙泊酚50 mg/kg 誘導(dǎo)神經(jīng)毒性損傷,Control組腹腔注射等量生理鹽水。 當(dāng)前期進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)給藥時,給藥劑量低于或等于5 mg/kg 時,均未出現(xiàn)明顯毒性作用,因此選擇給藥劑量5 mg/kg 為最高給藥劑量,倍數(shù)遞減劑量確定給藥梯度為:5、2.5、1.25 mg/kg。 Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg 組、Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg 組和 Propofol+Agmatine 5 mg/kg 組腹腔注射胍基丁胺 1.25、2.5、5 mg/kg[9],Control 組和Propofol 組腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.2 跳臺實(shí)驗(yàn)

將各組大鼠于實(shí)驗(yàn)前1 d 置于反應(yīng)箱中適應(yīng)3 min,實(shí)驗(yàn)時將大鼠放在平臺上并接通銅柵電源,記錄各組大鼠3 min 內(nèi)錯誤次數(shù);第2 天直接將大鼠放于接通銅柵電源的平臺上,記錄3 min 內(nèi)錯誤次數(shù)。

1.3.3 2,3,5-三苯基氯化四氮唑法

處死所有大鼠,取腦,稱取重量并石蠟包埋切片。 按照染液說明書,將新鮮腦組織切片置于裝有TTC 染液的培養(yǎng)皿中,37℃避光孵育30 min,用組織沖洗應(yīng)用液將組織表面多余染色液沖洗掉,正常腦組織呈玫瑰紅色,梗死組織呈灰白色。 再將切片置于10%甲醛中固定24 h,稱重,記為濕重;剝離梗死組織,與正常組織一起放入烘箱,烘至恒重,稱重,記為干重。 然后計(jì)算大鼠腦含水率、腦指數(shù)。 腦含水率(%)=(濕重-干重)/濕重×100%,腦指數(shù)(%)=大腦重量/體重×100%。

1.3.4 腦損傷評分

通過Longa 法[10]對各組大鼠神經(jīng)功能缺陷、姿勢反射進(jìn)行評分。

1.3.5 HE 染色

取各組大鼠腦組織石蠟包埋切片,采用蘇木素-伊紅(HE)染液,將石蠟切片脫蠟,蒸餾水潤濕組織,核染液染色5 min,水洗5 s,漿染液染色30 s,水洗后,濾紙吸干,無水乙醇脫水2 次后封片,在熒光顯微鏡下觀測。

1.3.6 Nissl 染色

取各組大鼠腦組織用10%福爾馬林固定液固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,冠狀切片,片厚5 μm,二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水,Nissl 染色液染色,中性樹脂封片,光鏡下觀察大腦海馬組織尼氏小體變化。

1.3.7 Western blot

取各組大鼠腦組織用含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取,BCA 試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。 提取等量的蛋白質(zhì)樣品在100℃條件下變性5 min。 然后使用SDS-PAGE 凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,在4℃條件下加入相應(yīng)一抗并孵育過夜,清洗,然后在4℃下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,孵育 2 h,最后加入發(fā)光液,曝光處理。Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胍基丁胺降低丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型犯錯次數(shù)、腦含水率和腦指數(shù)

通過跳臺實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠犯錯次數(shù)結(jié)果如圖1A 所示,與Control 組相比較,Propofol 組犯錯次數(shù)顯著升高(P<0.05)。 與 Propofol 組相比較,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組犯錯次數(shù)顯著降低(P<0.05);通過2,3,5-三苯基氯化四氮唑法檢測各組大鼠腦含水率、腦指數(shù)結(jié)果如圖1B、1C 所示,與Control 組相比較,Propofol 組腦含水率、腦指數(shù)顯著升高(P<0.05)。 與 Propofol 組相比較,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組腦含水率、腦指數(shù)顯著降低(P<0.05)。

注:A:犯錯次數(shù);B:腦含水率;C:腦指數(shù)。 1:對照組;2:丙泊酚組;3:丙泊酚+胍基丁胺 1.25 mg/kg 組;4:丙泊酚+胍基丁胺 2.5 mg/kg組;5:丙泊酚+胍基丁胺 5 mg/kg 組。 與 Control 組比較,?P<0.05;與 Propofol 組比較,#P<0.05。圖1 胍基丁胺對丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型犯錯次數(shù)、腦含水率、腦指數(shù)的影響Note.A, number of mistakes.B, Cerebral water content.C, Cerebral index.1,Control group.2, Propofol group.3, Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg group.4, Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg group.5, Propofol+Agmatine 5 mg/kg group.Compared with Control group, ?P<0.05.Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 1 Effects of guanidine on the number of errors, brain water content and brain index of propofol induced nerve injury in rat model

2.2 胍基丁胺降低丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型神經(jīng)功能缺陷評分、姿勢反射評分

通過Longa 法評價(jià)各組大鼠神經(jīng)功能缺陷評分、姿勢反射評分結(jié)果如圖2A、2B 所示,與Control組相比較,Propofol 組神經(jīng)功能缺陷評分、姿勢反射評分顯著升高(P<0.05)。 與 Propofol 組相比較,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組神經(jīng)功能缺陷評分、姿勢反射評分顯著降低(P<0.05)。

2.3 胍基丁胺改善丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型病理損傷程度,升高BDNF、NGF 蛋白表達(dá)水平

通過HE 染色檢測各組大鼠海馬區(qū)病理損傷程度結(jié)果如圖3A 所示,Control 組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰。 Propofol 組神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,間隙增大,細(xì)胞核染色變深,核固縮。 Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組較 Propofol 組病理損傷程度均有不同程度明顯改善。 通過Western blot 檢測各組大鼠BDNF、NGF 蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖3B 所示,與 Control 組相比較,Propofol 組 BDNF、NGF 蛋白水平顯著降低(P<0.05)。 與 Propofol 組相比較,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組 BDNF、NGF蛋白水平顯著升高(P<0.05)。

注:A:神經(jīng)功能缺陷評分;B:姿勢反射評分。 1:對照組;2:丙泊酚組;3:丙泊酚+胍基丁胺 1.25 mg/kg 組;4:丙泊酚+胍基丁胺 2.5 mg/kg 組;5:丙泊酚+胍基丁胺 5 mg/kg 組。 與 Control 組比較,?P<0.05;與 Propofol 組比較,#P<0.05。圖2 胍基丁胺對丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型神經(jīng)功能缺陷評分、姿勢反射評分的影響Note.A,Neurologic deficit scores.B, Postural reflex score.1,Control group; 2, Propofol group; 3, Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg group; 4, Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg group;5,Propofol+Agmatine 5 mg/kg group.Compared with Control group, ?P<0.05.Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 2 Effects of guanidine on scores of neural functional defects and postural reflex in propofofo induced nerve injury rats

注:A:HE 染色檢測海馬區(qū)病理損傷;B:BDNF、NGF 蛋白表達(dá)。 1:對照組;2:丙泊酚組;3:丙泊酚+胍基丁胺1.25 mg/kg 組;4:丙泊酚+胍基丁胺 2.5 mg/kg 組;5:丙泊酚+胍基丁胺 5 mg/kg 組。 與 Control 組比較,?P<0.05;與 Propofol 組比較,#P<0.05。圖3 胍基丁胺對丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型病理損傷程度和BDNF、NGF 蛋白表達(dá)水平的影響Note.A, HE staining was used to detect pathological damage in the hippocampus.B, protein expression of BDNF and NGF.1, Control group; 2,Propofol group; 3, Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg group; 4, Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg group; 5, Propofol+Agmatine 5 mg/kg group.Compared with Control group, ?P<0.05; Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 3 Effects of guanidine on the degree of pathological damage and the expression levels of BDNF and NGF proteins in propofofo-induced nerve injury rat models

2.4 胍基丁胺抑制丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型海馬區(qū)組織凋亡,降低Bax/Bcl-2 比值

通過Nissl 染色檢測各組大鼠海馬區(qū)組織凋亡情況結(jié)果如圖4A 所示,與 Control 組相比較,Propofol 組大鼠Nissl 小體數(shù)目明顯減少,而Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組相比較 Propofol 組 Nissl小體數(shù)目明顯增多,說明胍基丁胺可以作用海馬體,提高神經(jīng)元的存活;通過Western blot 檢測各組大鼠Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖4B 所示,與Control 組相比較,Propofol 組 Bax/Bcl-2 比值顯著升高(P<0.05)。 與 Propofol 組相比較,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組 Bax/Bcl-2 比值顯著降低(P<0.05)。

2.5 胍基丁胺升高丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型p-Nrf2/Nrf2 比值和HO-1 蛋白表達(dá)水平

通過 Western blot 檢測各組大鼠 Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖5 所示,與Control 組相比較,Propofol 組p-Nrf2/Nrf2 比值和HO-1 蛋白水平顯著降低(P<0.05)。 與 Propofol 組相比較,Propofol+Agmatine 2.5、5 mg/kg 組 p-Nrf2/Nrf2 比值和HO-1 蛋白水平顯著升高(P<0.05)。

注:A:Nissl 染色檢測海馬區(qū)組織細(xì)胞凋亡;Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)。 1:對照組;2:丙泊酚組;3:丙泊酚+胍基丁胺 1.25 mg/kg 組;4:丙泊酚+胍基丁胺 2.5 mg/kg 組;5:丙泊酚+胍基丁胺 5 mg/kg 組。 與Control 組比較,?P<0.05;與Propofol 組比較,#P<0.05。圖4 胍基丁胺對丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型海馬區(qū)組織凋亡和Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的影響Note.A, Nissl staining was used to detect the apoptosis of hippocampal tissue cells.Expression of Bax and Bcl-2 proteins.1, Control group.2, Propofol group.3, Propofol+Agmatine 1.25 mg/kg group.4, Propofol+Agmatine 2.5 mg/kg group.5, Propofol+Agmatine 5 mg/kg group.Compared with Control group, ?P<0.05.Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 4 Effects of guanidine on propofol induced hippocampal tissue apoptosis and Bax and Bcl-2 protein expression levels in rats with nerve injury

注:A: Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá);B:Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)直方圖。 與Control 組比較,?P<0.05;與 Propofol 組比較,#P<0.05。圖5 胍基丁胺對丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)水平的影響Note.A, Nrf2, p-Nrf2, HO-1 protein expression.B, the protein expression histogram of Nrf2, p-Nrf2 and HO-1.Compared with Control group, ?P<0.05.Compared with Propofol group, #P<0.05.Figure 5 Effects of guanidine on the expression levels of Nrf2, p-Nrf2 and HO-1 proteins in propofol induced nerve injury rat models

3 討論

本研究顯示,胍基丁胺具有降低丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型犯錯次數(shù)、腦含水率和腦指數(shù)的作用。 犯錯次數(shù)的降低表明大鼠被動記憶能力升高。 腦指數(shù)的升高反映了腦水腫的嚴(yán)重程度,控制腦水腫可以改善神經(jīng)損傷。 表明胍基丁胺能有效緩解丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠腦水腫。

神經(jīng)功能缺陷評分是評價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的重要方法[11]。 由于腦損傷時可致姿勢反應(yīng)性異常,出現(xiàn)異常姿勢、異常姿勢反射和異常運(yùn)動,姿勢反射評分可早期發(fā)現(xiàn)腦損傷[12]。 本文研究結(jié)果說明,應(yīng)用丙泊酚會對幼年大鼠學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生明顯影響。 而腹腔注射胍基丁胺后神經(jīng)功能缺陷評分和姿勢反射評分降低,則表明胍基丁胺改善丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠的神經(jīng)功能。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)生長因子(nerve growthfactor,NGF)是中樞神經(jīng)級聯(lián)信號傳遞的關(guān)鍵分子,能促進(jìn)神經(jīng)突觸生長而建立神經(jīng)元和靶細(xì)胞之間的突觸聯(lián)系[13]。 BDNF 參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化、再生以及修復(fù),維持成熟神經(jīng)元功能, 防止神經(jīng)元壞死及凋亡[14]。BDNF 可作為判定幼兒腦損傷的的檢測指標(biāo)。 NGF則是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子,在神經(jīng)元保護(hù)和神經(jīng)損傷后功能重建等方面起重要作用。王宏燕等[15]研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)元損傷可造成神經(jīng)元NGF、BDNF 表達(dá)下調(diào),可通過升高NGF 和BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)修復(fù)大腦海馬區(qū)神經(jīng)元。 本文研究發(fā)現(xiàn),胍基丁胺具有升高丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型BDNF、NGF 蛋白表達(dá)水平的作用。提示胍基丁胺改善丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型神經(jīng)元損傷。

注射丙泊酚可增加大鼠海馬細(xì)胞凋亡的頻率,由于丙泊酚對不同物種的未成熟神經(jīng)元有不利影響,即使使用亞麻醉劑量的丙泊酚進(jìn)行治療,也會在新生鼠的大腦皮層,尾狀和殼狀核中引起神經(jīng)元凋亡[8]。 在本研究中,我們觀察到尼氏小體在胍基丁胺藥物組中增多,且Bax/Bcl-2 比值降低,Bax/Bcl-2 比值是決定細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵指標(biāo)[16]。 表明胍基丁胺可抑制丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

Nrf2 是一種體內(nèi)的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子,當(dāng)機(jī)體受到不利刺激時在胞質(zhì)中從Keap-1 上解離出來,啟動下游 HO-1、NQO1 及 SOD 等抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[17]。 HO-1 在體內(nèi)具有抗氧化、細(xì)胞保護(hù)作用,其降解血紅素的產(chǎn)物代謝中可清除氧自由基、超氧陰離子,阻止蛋白、脂質(zhì)過氧化。 在腦內(nèi)激活Nrf2 途徑能起到神經(jīng)保護(hù)的作用[18]。 本文研究發(fā)現(xiàn),胍基丁胺具有升高丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型p-Nrf2/Nrf2 比值和HO-1 蛋白表達(dá)水平。 提示胍基丁胺通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1 信號通路減輕丙泊酚誘導(dǎo)的新生大鼠的神經(jīng)毒性。

綜上所述,胍基丁胺具有降低丙泊酚誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷大鼠模型犯錯次數(shù)、腦含水率、腦指數(shù)、神經(jīng)功能缺陷評分、姿勢反射評分、Bax/Bcl-2 比值,改善病理損傷程度,升高BDNF、NGF 蛋白表達(dá)水平,抑制海馬區(qū)組織凋亡,這可能是通過激活Nrf2/HO-1信號通路實(shí)現(xiàn)的。