黃 鐘孫 潔姚振濱李桂花?許曉剛

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診內(nèi)科,新疆石河子 832000;2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院院內(nèi)感染控制辦公室,新疆石河子 832000)

膿毒癥是機(jī)體對感染反應(yīng)失調(diào)所致的危及生命的器官功能障礙,其發(fā)病率和死亡率均較高[1]。雖然近年來,醫(yī)藥發(fā)展迅速,但對于嚴(yán)重的膿毒癥患者機(jī)體對感染刺激的機(jī)體的免疫、內(nèi)分泌代謝、炎癥、凝血等系統(tǒng)在感染時(shí)的綜合反應(yīng)的治療仍不完善[2]。 臨床上所采取的治療方法以支持治療為主,但隨著對分子細(xì)胞學(xué)研究的深入,miRNA 在調(diào)控細(xì)胞凋亡及相關(guān)惡性生物學(xué)特征中發(fā)揮了重要作用[3]。 近年來隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)miR-128-3p在相關(guān)疾病中扮演重要角色。 趙陽等[4]研究表明miR-128-3p 過表達(dá)可以靶向MAPK1 抑制膀胱癌細(xì)胞株的侵襲,遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。 侯紹蔚研究表明miR-128-3p 靶向TCF4 抑制黑色素瘤A375 細(xì)胞增殖、侵襲[5]。 張華東等[6]研究表明 miR-128-3p 能通過靶向BMI 調(diào)控炎癥反應(yīng)。 由此我們推測miR-128-3p 對毒癥大鼠急性肺損傷中相關(guān)細(xì)胞的凋亡及炎癥反應(yīng)可能有一定的影響。 但目前關(guān)于miR-128-3p 在膿毒癥大鼠急性肺損傷的炎癥反應(yīng)和肺組織形態(tài)學(xué)的影響研究較少。 本文旨在研究miR-128-3p 對膿毒癥大鼠急性肺損傷炎癥反應(yīng)、肺組織形態(tài)學(xué)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí) 3 周齡 SD 大鼠,體重(60±6)g,60 只,購自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2019-0050],于廣東省檢迅檢測科技有限公司SPF 級(jí)動(dòng)物房中進(jìn)行飼養(yǎng)[SYXK(粵)2019-0216],自由飲水和進(jìn)食,溫度維持25℃左右,光照/黑暗各12 h,常規(guī)飼養(yǎng)。 本實(shí)驗(yàn)通過本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20180201);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)減少(reduction)、優(yōu)化(refinement)和替代(replacement)-3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

TRAIL(英國 Pepro Tech 公司); Caspase-3、Caspase-9、轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transformed growth factor-β, TGF-β) 抗體(貨號(hào):ab179695;批號(hào):20190103)和 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(Alpha-smooth muscle actin, α-SMA)抗體(貨號(hào):ab240678;批號(hào):20190401)(艾博抗公司);HRP 羊抗兔 IgG、HRP 羊抗鼠IgG 抗體(美國Thermo 公司);白細(xì)胞介素-6(interleukin- 6, IL-6)試劑盒(貨號(hào):SBJ-H0465;批號(hào)20190301)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒(貨號(hào):SBJ-H0038;批號(hào)20190304)、一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)ELISA 試劑盒購(貨號(hào):SBJ-H1350;批號(hào):20190307)(南京森貝伽生物科技有限公司);MASSON 染液(貨號(hào):SNM346,北京百奧萊博科技有限公司);TUNEL 染液(貨號(hào):11684817910,上海意杰生物科技)。

Sysmex-chemix-180 全自動(dòng)生化分析儀(日本Furuno Electric 公司);TDL-5 臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);3w-5 低溫離心機(jī)(湖南恒諾離心機(jī)有限公司);SG-51 金相顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及建立模型

將60 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周,采用隨機(jī)分組法將大鼠分為:假手術(shù)組、膿毒癥模型組、空白轉(zhuǎn)染組和miR-128-3p 沉默組,每組15 只,除假手術(shù)組其余各組大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備大鼠膿毒癥模型,操作流程參考文獻(xiàn)[7]:大鼠麻醉,去毛發(fā),腹正中線作長3 cm 的切口,結(jié)扎位置選取距離盲端1.5 cm 處,結(jié)扎遠(yuǎn)端進(jìn)行針穿并擠出少許腸管內(nèi)糞便,再將盲腸回納腹腔,關(guān)腹并進(jìn)行補(bǔ)液。 假手術(shù)組不結(jié)扎及針頭對穿盲腸,其余步驟相同。 判斷模型成功標(biāo)準(zhǔn)參考秦怡等[8]研究,大鼠活動(dòng)減少、攝食減少、嗜睡、蜷縮、眼角出現(xiàn)分泌物等,7 h 血培養(yǎng)陽性為模型成功,同時(shí)導(dǎo)致肺功能損傷為造模成功。 肺纖維化評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[9]:呈現(xiàn)出慢性肺泡炎且其中成分出現(xiàn)進(jìn)行性損害,纖維組織大量增生、間質(zhì)膠原紊亂甚至出現(xiàn)囊性變化,肺泡陰影呈現(xiàn)出磨玻璃狀,嚴(yán)重進(jìn)展時(shí)可出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀或網(wǎng)狀陰影。

1.3.2 干預(yù)

空白轉(zhuǎn)染組構(gòu)建空白質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染大鼠;miR-128-3p 沉默組構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒并通過尾靜脈注射轉(zhuǎn)染大鼠,設(shè)計(jì)3 個(gè)miR-128-3p 基因的干擾片段,合成單鏈DNA 片段,片段兩端分別含酶切位點(diǎn),退火形成雙鏈DNA。 雙酶切miR-128-3p 沉默基因載體和DNA 片段,3"4 DNA 連接酶連接(由武漢華聯(lián)科有限公司完成)。

1.3.3 RT-PCR 檢測 miR-128-3p 表達(dá)

肺功能檢測完畢24 h 后,處死大鼠并取出肺組織,TRIzol 提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄cDNA 鏈并作為PCR擴(kuò)增模板,95℃ 2 min、95℃ 8 s、58℃ 35 s、72℃ 40 s、40 個(gè)循環(huán),使用2-ΔΔCt計(jì)算出待測基因相對表達(dá)量。miR-128-3p:上游引物:5’-GTGCAGGGTCCGA GGT-3’下游引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’。

GADPH:上游引物:5’-CTCAGACACCATGGG GAGGTGA-3’ 下游引物:5’-ATGATCTTGAGGCTG TTGTCATA-3’。

1.3.4 各組大鼠肺功能的檢測

完成大鼠基因干預(yù)24 h 后,采用 AniRes2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng),在常溫下,將大鼠置體描器內(nèi),檢測大鼠靜息通氣量、氣道阻力改變和肺容積變換情況。

1.3.5 大鼠外周血相關(guān)因子檢測

斷頸法處死大鼠后立即取大鼠血液2 mL,在離心機(jī)中以 1500 r/min 離心 15 min,取上清液用ELISA 法檢測 IL-6、TNF-α、iNOS 含量水平,按照試劑盒說明書操作。

1.3.6 HE 染色觀察肺組織及病理損傷情況

HE 染色觀察大鼠肺上皮組織及病理損傷情況,取大鼠肺上皮組織,依次進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精染色、伊紅染色、封片、高倍鏡觀察大鼠肺組織情況。

1.3.7 TUNEL 染色檢測大鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況

將肺上皮組織切片,依次經(jīng)過二甲苯清洗、乙醇清洗、蛋白酶K 室溫反應(yīng)15 min、10%中性甲醛固定、乙醇乙酸浸潤、3%過氧化氫浸潤、TdT 酶緩沖溶液孵育5 min、終止液終止反應(yīng)20 min、過氧化酶標(biāo)記物抗體孵育20 min、DAB 顯色30 min、無水乙醇和二甲苯固定、晾干、封片,于熒光顯微鏡下觀察,凋亡率=陽性細(xì)胞/總細(xì)胞×100%。

1.3.8 Western blot 檢測蛋白表達(dá)水平

提取肺組織總蛋白,依次經(jīng)過SDS 電泳、蛋白轉(zhuǎn)PVDF 膜、室溫封閉2 h、加入待檢測蛋白一抗,4℃孵育過夜,加入二抗37℃孵育2 h,顯色液顯色,進(jìn)行目標(biāo)蛋白條帶灰度值吸光度分析。

1.3.9 MASSON 染色檢測大鼠肺組織情況

大鼠肺組織石蠟切片,進(jìn)行Masson 染色試劑盒中A、B 染色液染色前和染色后步驟與 HE 染色相同。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Sigma Stat 3.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),使用GraphPad Prism 5 軟件作圖,計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,多組間用單因素方差分析,兩兩比較用LSD 法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測 miR-128-3p 表達(dá)

由RT-PCR 檢測miR-128-3p 表達(dá)發(fā)現(xiàn),相比假手術(shù)組,膿毒癥模型組大鼠和空白轉(zhuǎn)染組大鼠miR-128-3p 表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.321;P=0.000);相比空白轉(zhuǎn)染組,miR-128-3p沉默組大鼠miR-128-3p 表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.368;P=0.000),見圖1。

2.2 各組大鼠肺功能的檢測結(jié)果

檢測大鼠肺功能可以看出,相比假手術(shù)組,膿毒癥模型組大鼠和空白轉(zhuǎn)染組大鼠靜息通氣量、氣道阻力改變和肺容積變換顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相比空白轉(zhuǎn)染組,miR-128-3p沉默組大鼠靜息通氣量、氣道阻力改變和肺容積變換顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

2.3 大鼠外周血相關(guān)因子檢測

使用ELISA 檢測大鼠外周血炎癥因子檢測結(jié)果顯示,相比假手術(shù)組,膿毒癥模型組大鼠和空白轉(zhuǎn)染組大鼠外周血IL-6 含量水平、iNOS 含量水平和TNF-α 含量水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相比空白轉(zhuǎn)染組,miR-128-3p 沉默組大鼠 IL-6 含量水平、iNOS 含量水平和 TNF-α 含量水平均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

注:I:假手術(shù)組;II:膿毒癥模型組;III:空白轉(zhuǎn)染組;IIV:miR-128-3p 沉默組。 與假手術(shù)組相比,?P<0.05;與空白轉(zhuǎn)染組相比,#P<0.05。圖1 RT-PCR 檢測 miR-128-3p 表達(dá)Note.I, Sham-operated group.II, Sepsis model group.III,Blank transfection group.IIV, miR-128-3p silencing group.Compared with sham-operated group, ?P<0.05.Compared with blank transfection group, #P<0.05.Figure 1 Expression of miR-128-3p detected by RT-PCR

2.4 HE 染色觀察肺組織及病理損傷情況

HE 染色觀察各組大鼠肺組織病理損傷發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組細(xì)胞分布均勻,且基本無壞死細(xì)胞;膿毒癥模型組和空白轉(zhuǎn)染組大鼠肺組織細(xì)胞排列散亂,且數(shù)量缺失明顯增多,壞死細(xì)胞較多;miR-128-3p沉默組細(xì)胞排列較均勻,壞死細(xì)胞明顯較少,見圖2。

2.5 TUNEL 染色檢測大鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況

TUNEL 染色觀察各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn),相比假手術(shù)組凋亡率為(2.00±2.00)%,膿毒癥模型組大鼠和空白轉(zhuǎn)染組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率分別為(38.50±5.00)%和(41.05±7.00)%顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.984;P=0.000);相比空白轉(zhuǎn)染組,miR-128-3p 沉默組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率為(9.00±3.00)%顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.321;P=0.000),見圖3。

2.6 各組大鼠肺組織中Caspase-3 和Caspase-9 的表達(dá)檢測結(jié)果

蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)檢測大鼠肺組織凋亡蛋白表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比假手術(shù)組,膿毒癥模型組大鼠和空白轉(zhuǎn)染組大鼠肺組織cleaved cas3/Caspase-3 和cleaved cas9/Caspase-9 比值顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.054,P=0.000;t=9.698,P=0.000);相比空白轉(zhuǎn)染組,miR-128-3p 沉默組大鼠cleaved cas3/Caspase-3 和 cleaved cas9/Caspase-9 比值顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=33.696,P=0.000;t=7.369,P=0.000),見圖4。

2.7 MASSON 染色檢測大鼠肺組織情況

MASSON 染色觀察各組大鼠肺組織傷發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組的大鼠肺組織細(xì)胞分布均與且有序,膿毒癥模型組肺組織纖維化和損傷程度嚴(yán)重,miR-128-3p 沉默組肺組織纖維化和損傷程度減輕,見圖5。

2.8 各組大鼠肺組織 TGF-β 和 α-SMA 表達(dá)情況

蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)檢測大鼠肺組織炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比假手術(shù)組,膿毒癥模型組大鼠和空白轉(zhuǎn)染組大鼠 TGF-β 蛋白相對表達(dá)和 α-SMA 蛋白相對表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.874,P=0.000;t=10.087,P=0.000);相比空白轉(zhuǎn)染組,miR-128-3p 沉默組大鼠TGF-β 蛋白相對表達(dá)和α-SMA 蛋白相對表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.344,P=0.000;t=5.360,P=0.000),見圖6。

表1 各組大鼠肺功能的檢測結(jié)果( ±s,n=15)Table 1 Test results of lung function of rates in each group

表1 各組大鼠肺功能的檢測結(jié)果( ±s,n=15)Table 1 Test results of lung function of rates in each group

注:與假手術(shù)組相比,?P<0.05;與空白轉(zhuǎn)染組相比,#P<0.05。Note.Compared with sham-operated group, ?P<0.05.Compared with blank transfection group, #P<0.05.

組別Groups靜息通氣量(mL/kg)Resting ventilation氣道阻力改變Airway resistance changes肺容積變換(mL)Lung volume changes假手術(shù)組 Sham-operated group 3.42±0.19 74.34±6.36 0.27±0.03膿毒癥模型組 Sepsis model group 1.59±0.22? 53.42±9.23? 0.11±0.04?空白轉(zhuǎn)染組 Blank transfection group 1.62±0.24? 52.46±5.16? 0.12±0.01?miR-128-3p 沉默組 miR-128-3p silencing group 2.81±0.32# 68.02±7.18# 0.24±0.02#F 201.767 34.370 134.000 P<0.001 <0.001 <0.001

表2 大鼠外周血炎癥因子檢測( ±s,n=15)Table 2 Detection of inflammatory factors in peripheral blood of rats

表2 大鼠外周血炎癥因子檢測( ±s,n=15)Table 2 Detection of inflammatory factors in peripheral blood of rats

注:與假手術(shù)組相比,?P<0.05;與空白轉(zhuǎn)染組相比,#P<0.05。Note.Compared with sham-operated group, ?P<0.05.Compared with blank transfection group, #P<0.05.

組別 Groups IL-6(pg/mL) iNOS(pg/mL) TNF-α(pg/mL)假手術(shù)組 Sham-operated group 18.07±3.35 42.08±6.09 27.03±2.35膿毒癥模型組 Sepsis model group 94.85±11.23? 205.92±24.11? 136.35±17.43?空白轉(zhuǎn)染組 Blank transfection group 98.83±16.44? 201.08±21.24? 138.53±13.26?miR-128-3p 沉默組 miR-128-3p silencing group 37.12±4.67# 81.77±7.52# 59.19±8.28#F 232.139 370.188 340.164 P<0.001 <0.001 <0.001

注:I:假手術(shù)組;II:膿毒癥模型組;III:空白轉(zhuǎn)染組;IIV:miR-128-3p 沉默組。圖2 HE 染色觀察肺組織病理損傷情況(n=15)Note.I, Sham-operated group.II, Sepsis model group.III, Blank transfection group.IIV, miR-128-3p silencing group.Figure 2 Observation of lung tissue and pathological damage by HE staining

注:A:TUNEL 染色圖;B:肺組織細(xì)胞凋亡率。 I:假手術(shù)組;II:膿毒癥模型組;III:空白轉(zhuǎn)染組;IIV:miR-128-3p 沉默組。 與假手術(shù)組相比,?P<0.05;與空白轉(zhuǎn)染組相比,#P<0.05。圖3 TUNEL 染色檢測大鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況(n=15)Note.A, TUNEL staining images.B, Apoptosis rates of lung tissues.I, Sham-operated group.II,Sepsis model group.III, Blank transfection group.IIV, miR-128-3p silencing group.Compared with sham-operated group, ?P<0.05.Compared with blank transfection group, #P<0.05.Figure 3 Apoptosis of lung tissues detected by TUNEL staining

注:A:蛋白質(zhì)印記圖;B:相關(guān)蛋白相對表達(dá)量。 I:假手術(shù)組;II:膿毒癥模型組;III:空白轉(zhuǎn)染組;IIV:miR-128-3p 沉默組。 與假手術(shù)組相比,?P<0.05;與空白轉(zhuǎn)染組相比,#P<0.05。圖4 各組大鼠肺組織中Caspase-3 和Caspase-9 的表達(dá)情況(n=15)Note.A, Western blot images.B, Relative expression levels of related proteins.I, Sham-operated group.II, Sepsis model group.III, Blank transfection group.IIV, miR-128-3p silencing group.Compared with sham-operated group, ?P < 0.05.Compared with blank transfection group,#P<0.05.Figure 4 Expression of Caspase-3 and Caspase-9 in lung tissues of rats in each group

注:I:假手術(shù)組;II:膿毒癥模型組;III:空白轉(zhuǎn)染組;IIV:miR-128-3p 沉默組。圖5 MASSON 染色檢測大鼠肺組織情況結(jié)果(n=15)Note.I, Sham-operated group.II, Sepsis model group.III, Blank transfection group.IIV, miR-128-3p silencing group.Figure 5 Lung tissue conditions of rats detected by MASSON staining

注:A:蛋白質(zhì)印記圖;B:相關(guān)蛋白相對表達(dá)量。 I:假手術(shù)組;II:膿毒癥模型組;III:空白轉(zhuǎn)染組;IIV:miR-128-3p 沉默組。 與假手術(shù)組相比,?P<0.05;與空白轉(zhuǎn)染組相比,#P<0.05。圖6 各組大鼠肺組織TGF-β 和α-SMA 表達(dá)情況(n=15)Note.A, Western blot images.B, Relative expression levels of related proteins.I, Sham-operated group.II, Sepsis model group.III, Blank transfection group.IIV, miR-128-3p silencing group.Compared with sham-operated group, ?P<0.05.Compared with blank transfection group, #P<0.05.Figure 6 Expression of TGF-β and α-SMA in lung tissues of rats in each group

3 討論

膿毒癥可以序貫出現(xiàn)多個(gè)器官功能損傷,其中肺部損傷較為常見[10]。 其中靜息通氣量、氣道阻力改變和肺容積變換是常見的幾個(gè)肺功能指標(biāo)。 靜息通氣量是指每分鐘靜息通氣量是指在平靜狀態(tài)下每分鐘進(jìn)或出肺的氣體總量[11];氣道阻力是指氣道內(nèi)單位流量所產(chǎn)生的壓力差[12];當(dāng)靜息通氣量和氣道阻力改變降低后可能因?yàn)榉尾砍霈F(xiàn)水腫或炎癥反應(yīng)引起肺阻塞。 本研究發(fā)現(xiàn),相比空白轉(zhuǎn)染組,miR-128-3p 沉默組大鼠靜息通氣量、氣道阻力改變和肺容積變換顯著升高。 說明抑制miR-128-3p的表達(dá)后,大鼠肺功能的到了有效緩解,這可能是因?yàn)檠装Y得到了有效抑制,使得大鼠肺部的水腫也得到了緩解。 黃小洵等[13]研究表明:改善靜息通氣量及相關(guān)肺功能指標(biāo)可以有效緩解膿毒癥導(dǎo)致的肺損傷,與本研究得出的結(jié)論相一致。

細(xì)胞因子主要可分為促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子兩種[14]。 目前研究較多的促炎性細(xì)胞因子包括:TNF-α、IL-1β,IL-6 和 IL-8 等;抗炎性細(xì)胞因子則包括:IL-4,IL-10,TNF 受體(TNF-sr)等[15],本研究中主要研究 IL-6、iNOS 和 TNF-α 這幾種相關(guān)因子。 為探究大鼠肺功能得到了的改善是否與降低炎癥反應(yīng)相關(guān),本研究檢測了大鼠外周血的相關(guān)因子發(fā)現(xiàn),相比空白轉(zhuǎn)染組,miR-128-3p 沉默組大鼠IL-6 含量水平、iNOS 含量水平和TNF-α含量水平均顯著降低。 說明大鼠的肺功能得到有效的改善確實(shí)與炎癥反應(yīng)相關(guān)。 同時(shí)為了進(jìn)一步驗(yàn)證,通過MASSON 染色觀察各組大鼠肺組織發(fā)現(xiàn),miR-128-3p 沉默組大鼠肺組織損傷及炎性浸潤也有顯著的改善。 吳松林等[16]研究表明:長鏈非編碼RNA 的表達(dá)可以有效抑制膿毒癥導(dǎo)致的肺損傷患者外周血內(nèi)的炎癥因子水平,與本研究得出的結(jié)論相類似。

除了抑制炎癥反應(yīng)以外,防止細(xì)胞的凋亡也是重要方法之一。 本研究通過TUNEL 染色,相比空白轉(zhuǎn)染組,miR-128-3p 沉默組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著降低,為了探究其原因,使用蛋白質(zhì)印跡檢測了相關(guān)凋亡基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn),相比空白轉(zhuǎn)染組,miR-128-3p 沉默組大鼠 cleaved cas3/Caspase-3 和cleaved cas9/Caspase-9 比值顯著降低。 這可能是因?yàn)镃aspase 家族蛋白為調(diào)控凋亡的主要蛋白之一。抑制了miR-128-3p 的表達(dá),使得肺組織細(xì)胞凋亡啟動(dòng)子 Caspase-3 的表達(dá)受到了抑制,減緩了下游caspase-9 的活化,使得凋亡信號(hào)減弱,反過來抑制了Caspase-3 的激活,防止了肺組織細(xì)胞的凋亡。 姜永帥等[17]研究表明:抑制膿毒癥患者體內(nèi)的Caspase 家族凋亡蛋白的表達(dá)可以有效緩解膿毒癥導(dǎo)致的相關(guān)器官功能損傷,與本研究得出的結(jié)論相一致。

肺纖維化是以成纖維細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)聚集并伴炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變[18]。 大鼠肺部出現(xiàn)損傷后會(huì)伴隨肺部纖維化。 肺纖維化主要標(biāo)志包括:α-SMA 和 TGF-β 等;α-SMA 主要存在于肌成纖維細(xì)胞漿,是肌成纖維細(xì)胞的主要標(biāo)志分子[19];TGF-β是肺纖維化最關(guān)鍵的細(xì)胞因子,它與肺纖維化發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞外基質(zhì)代謝關(guān)系密切[20]。 本實(shí)驗(yàn)通過MASSON 染色觀察發(fā)現(xiàn),膿毒癥模型組大鼠肺組織出現(xiàn)明顯的組織纖維化,與膿毒癥模型組相比,肺組織的纖維化和損傷明顯得到改善為探究其原因,檢測了與肺纖維化相關(guān)的蛋白,發(fā)現(xiàn)相比空白轉(zhuǎn)染組,miR-128-3p 沉默組大鼠TGF-β 蛋白相對表達(dá)和α-SMA 蛋白相對表達(dá)顯著降低。 說明抑制 miR-128-3p 基因的表達(dá)可以有效防止肺纖維化,其作用機(jī)制可能與抑制肺纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)相關(guān)。秦靜等[21]研究表明:抑制大鼠體內(nèi) TGF-β 蛋白相對表達(dá)和α-SMA 蛋白相對表達(dá)可以有效治療肺纖維化進(jìn)展,與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述,下調(diào)miR-128-3p 可以緩解膿毒癥大鼠急性肺損傷,其作用機(jī)制可能與降低大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)并抑制肺組織細(xì)胞的凋亡相關(guān)。