劉勝男，侯鐵英，廖建楓，史艷萍，鄭有為，吳 際，黃 革*

[1.廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學科學院) 檢驗科，廣東 廣州510080；2.南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院第四派駐門診部 檢驗科，廣東 廣州510010]

急性呼吸道感染(ARTI)是最常見的感染性疾病之一，發(fā)病率居急性傳染病的首位。95%的急性上呼吸道疾病和大部分的下呼吸道疾病是由細菌外的病原引起的，例如病毒、支原體或衣原體等，且容易出現(xiàn)復合感染。核酸雙擴增法作為新研發(fā)的病原體核酸檢測分子生物學技術，可以一次性檢測流感病毒(FluA/FluB)、副流感病毒(PIV- 1/2/3)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(AdV-B/E)、肺炎支原體(MP)以及肺炎衣原體(Cpn)7種較為常見的引起急性呼吸道感染的細菌外病原體。此外，已有研究證實咽候拭子是目前監(jiān)測呼吸道病原體的首選標本之一[1]。本文采用核酸恒溫雙擴增法檢測2460例呼吸道感染患者咽喉拭子中7種呼吸道病原體RNA并對其結(jié)果進行分析，旨在探討呼吸道病原體現(xiàn)癥感染的分布情況，以及在不同性別、年齡組、季節(jié)的感染特點，為臨床防治提供準確、有效的病原學依據(jù)及流行病學參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年3月至2020年2月廣東省人民醫(yī)院門診及住院呼吸道感染患者2460例。排除重復病例。其中，女性874例，男性1586例；少年組(<18歲)687例；青年組(18-44歲)318例；中年組(45-59歲)346例；老年組(>59歲)1109例，年齡劃分參照世界衛(wèi)生組織 (WHO) 2016 年年齡分類標準[2]。

1.2 儀器與試劑

試劑為武漢中幟生物科技股份有限公司研制的7項呼吸道病原體核酸檢測試劑盒(雙擴增法)。儀器為Tethys85全自動化學發(fā)光酶免儀和MiniG-R100干式恒溫器。

1.3 檢測方法

使用咽喉植絨拭子采集患者咽部上皮細胞并置于細胞保存液中，當日及時檢測，未能及時檢測標本置-20℃保存。采用核酸恒溫雙擴增法定性檢測患者咽部脫落細胞中7種呼吸道病原體RNA，包括流感病毒(FluA/ FluB)、副流感病毒(PIV- 1/2/3)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(AdV-B/E)、肺炎支原體(MP)以及肺炎衣原體(Cpn)。每個樣本均同時檢測18SrRNA以保證咽喉拭子取材成功，每批次試驗均設立陽性和陰性對照。根據(jù)試劑盒說明書判讀結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或者Yates連續(xù)性校正χ2檢驗，當P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 7種呼吸道病原體mRNA陽性檢出率

2460例呼吸道感染患者中，呼吸道7項病原體RNA陽性208例，陽性檢出率為8.46%(208/2460)。其中單一感染200例，占比96.15%(200/208)，混合感染8例，占比3.85%(8/208)。單一感染為主要的感染模式?；旌细腥局饕母腥灸Ｊ綖楹粑篮习《竞喜⒏绷鞲胁《?，有4例，檢出率為0.16%，在混合感染中占比50%。在7種呼吸道病原體中，陽性率最高的是呼吸道合胞病毒，70例陽性，陽性率為2.85%，占總陽性的33.65%，其次為肺炎支原體和副流感病毒。各病原體RNA陽性檢出率見表1。

表1 2460例咽喉拭子標本呼吸道病原體RNA陽性檢出率

2.2 7種呼吸道病原體RNA在不同性別、年齡和季節(jié)的陽性檢出情況

2.2.1不同性別呼吸道病原體RNA陽性檢出情況 女性肺炎支原體RNA的陽性檢出率(3.20%)顯著高于男性(1.89%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余6種病原體的陽性檢出率無性別差異(P>0.05)，見表2。

表2 不同性別組呼吸道病原體RNA陽性檢出率

2.2.2不同年齡組呼吸道病原體RNA陽性檢出情況 不同年齡組呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒的陽性檢出率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。少年組呼吸道合胞病毒的陽性率(3.93%)、副流感病毒的陽性率(3.35%)、腺病毒的陽性率(1.31%)高于其他年齡組，見表3。

表3 不同年齡組呼吸道病原體RNA陽性檢出率

2.2.3不同季節(jié)呼吸道病原體RNA陽性檢出情況 甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肺炎支原體RNA陽性檢出率在不同季節(jié)中比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，春季的陽性檢出率最高；甲型流感病毒和呼吸道合胞病毒在秋季的陽性檢出率最低；副流感病毒和肺炎支原體在冬季的陽性檢出率最低，見表4。

表4 不同季節(jié)呼吸道病原體RNA陽性檢出率

3 討論

呼吸道感染是臨床最常見的疾病之一，由于引起急性呼吸道感染的病原體種類繁多、傳播快、感染力強，且同一種病原體可引起多種臨床癥狀，不同的病原體亦可引起相似的臨床癥狀[3-4]，因此要求實驗室能夠?qū)粑啦≡w快速檢測和早期鑒別以協(xié)助臨床對呼吸道感染進行早期防控和治療[5]。作為引起急性呼吸道感染最主要的病原體，病毒、支原體或衣原體難以培養(yǎng)，而免疫學檢測則有抗原檢測靈敏度低，抗體檢測窗口期的缺點，因此，分子生物學檢測技術成為其首選手段。恒溫雙擴增技術作為新型分子檢測手段，通過T7線性擴增和多生物素信號放大系統(tǒng)檢測病原體在宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的mRNA，反映的是病原體在宿主體內(nèi)的復制活性，有效甄別患者呼吸道感染是否為現(xiàn)癥感染，從而為臨床提供更準確的診斷信息。

由于不同地區(qū)和不同年份的病原體流行性不盡相同[6-7]，所以定期或不定期對本地區(qū)呼吸道感染的病原學和流行病學調(diào)查研究對呼吸道感染的有效預防尤為重要[8]。本文通過對2019年3月至2020年2月呼吸道感染患者mRNA檢測結(jié)果分析來提供該時間段呼吸道疾病現(xiàn)癥感染的流行病學特征。

本研究對廣州地區(qū)2640例呼吸道感染患者7種呼吸道病原體mRNA檢測結(jié)果分析，陽性率為8.46%，低于之前研究報道的呼吸道病原體IgM抗體檢出率[4,8-9]，也明顯低于已有報道的通過熒光定量PCR檢測的呼吸道病原體核酸的檢出率[10]。我們分析可能存在幾方面的原因。一方面，由于不同地區(qū)，不同年份的季節(jié)氣候特點以及人群易感性不同，呼吸道病原檢測陽性率在不同地區(qū)或者不同年份可能存在一定差異。廣州屬于海洋性亞熱帶季風氣候，溫暖多雨，夏季長，冬季陰冷時間短，呼吸道病原體流行時間較北方地區(qū)短。另一方面，我們檢測的是病原體在宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的mRNA，只有現(xiàn)癥感染患者才可能檢測陽性，而有研究指出呼吸道病原體的特異性IgM抗體可在感染后的2-3個月持續(xù)存在[11]。MP感染后1個月時其DNA的檢出率仍然高達50%，MP-DNA持續(xù)攜帶的中位數(shù)時間為7周，個別長達7個月之久[12]；此外，2020年1月至2月期間，由于COVID-19疫情的爆發(fā)和居家隔離防疫策略的實施，也有效阻斷了其它呼吸道病毒的傳播和流行，使本該高發(fā)呼吸道疾病的冬季各病原體的陽性檢出率顯著下降，進而導致統(tǒng)計期間這七種呼吸道病原體總陽性檢出率的下降。就單一病原體而言，甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒的陽性檢出率高于之前抗體IgM檢測的報道，肺炎衣原體與腺病毒陽性率與報道相一致，而肺炎支原體、乙型流感病毒、副流感病毒陽性檢出率則低于之前的研究[8]。

此外，本研究也從性別、年齡、季節(jié)等幾個方面分析了廣州地區(qū)急性呼吸道傳染病的流行特點。研究發(fā)現(xiàn)女性患者肺炎支原體陽性率顯著高于男性患者(P<0.05)，但由于本研究中男女構(gòu)成比有較大差異且目前針對性別對呼吸道傳染病影響的研究尚少，因此結(jié)論還需進一步證實。年齡方面，研究結(jié)果顯示少年組呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒的陽性率顯著高于其他年齡組，與王麗等人的研究一致[8]。其可能原因一是由于少年人群頻繁出入學校、公共交通等人群密集的公共場所，有更多的機會接觸呼吸道病原體引起交叉感染，另一是少年人群免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完全，對呼吸道病原體的抵抗力較成年人差，是呼吸道病原體感染的高危人群，導致呼吸道病原體更容易在少年人群中傳播。季節(jié)方面，研究結(jié)果顯示呼吸道病原體的流行與季節(jié)有密切關系。甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肺炎支原體的陽性檢出率在四個季節(jié)中存在顯著性差異(P<0.05)，春季的陽性檢出率最高，這與謝紅梅等人的研究相一致[9]，提示春季為廣州地區(qū)呼吸道傳染病的高峰季節(jié)，廣州地區(qū)應在春季加強呼吸道傳染病的防護工作。值得注意的是，由于廣州地區(qū)冬季較暖，而且因COVID-19疫情居家隔離相關政策的影響，本研究結(jié)果顯示廣州地區(qū)呼吸道病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體的流行情況并未像北方地區(qū)那樣在冬季表現(xiàn)得尤為嚴峻，還需更多數(shù)據(jù)進一步論證。

綜上所述，呼吸道病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體現(xiàn)癥感染的主要模式為單一感染，少數(shù)病例表現(xiàn)為混合感染；其中，呼吸道合胞病毒和肺炎支原體的陽性率最高，在全年均有檢出；少年組的陽性檢出率最高，春季是陽性檢出率最高的季節(jié)。本研究通過對廣州地區(qū)2460例呼吸道感染患者7種呼吸道病原體RNA檢測結(jié)果分析為廣州地區(qū)呼吸道感染的病原學和流行病學研究提供了相關數(shù)據(jù)。