黃雅麗 ，賴安萍 ，侯柚銀 ，張華峰 ，劉希華

（1.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建 三明 365004；2.福建省礦山生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)研究中心，福建 三明 365004；3.廈門市森林病蟲害防治技術(shù)站，福建 廈門 361004）

我國作為一個礦產(chǎn)資源相對豐富的國家，礦產(chǎn)資源大量利用促進(jìn)了國民經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，同時因礦產(chǎn)資源的開發(fā)利用而產(chǎn)生了生態(tài)環(huán)境問題。重金屬污染具有隱蔽性和高額治理成本等特點(diǎn)，特別是對土壤的污染具有不可逆的作用，并通過植物和作物產(chǎn)品轉(zhuǎn)接到人類的食物鏈環(huán)節(jié)，由此引起重金屬對人類的毒害。從2018年福建省環(huán)保廳下發(fā)文件《福建省涉重金屬行業(yè)污染防控工作方案》中提及，在所有福建省的重點(diǎn)污染物中，鉛位居5種重金屬污染之首。在修復(fù)重金屬污染土壤的技術(shù)中，化學(xué)、物理和生物修復(fù)這三種方法最為有效，前兩者或存在產(chǎn)生二次污染，或者費(fèi)用高等缺點(diǎn)，生物修復(fù)技術(shù)則避開了上述兩種修復(fù)方法的缺點(diǎn)，特別是微生物和植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤，這種方法克服了受鉛脅迫的植物生長緩慢以及吸附的重金屬難以從土壤中除去等缺點(diǎn)，其修復(fù)效果逐步受到科學(xué)工作者的認(rèn)可[1-3]。

紅葉石楠（Photinia serrulata）是福建地區(qū)常見的小喬木或灌木，新梢和新葉為鮮紅色，且不受環(huán)境中鉛離子的毒害，目前作為公路街道路旁的行道樹而大量種植[4]。但由于紅葉石楠生物量較小，不適合于礦山等大面積鉛污染的修復(fù)，因此從耐鉛的植物上分離純化出耐鉛的內(nèi)生細(xì)菌，并接種到喬木上，從而選育出適合礦山種植的樹種，以達(dá)到修復(fù)礦山等大面積鉛污染土壤的目的。

關(guān)于耐鉛的內(nèi)生細(xì)菌的研究鮮有報道，僅本課題組從小飛蓬(Conyza canadensis)和龍葵(Solanum nigrum)等草本植物上成功分離出耐鉛的內(nèi)生細(xì)菌[5-6]，但由于草本植物多為一年本植物，且沒有木本植物的高大樹干，因此，無法確定分離出來的內(nèi)生細(xì)菌能否成功殖在木本植物。有研究表明，內(nèi)生細(xì)菌與宿主植物組織表面的親和機(jī)制如何,可能會影響到內(nèi)生細(xì)菌侵染宿主植物的效率，并可能是影響內(nèi)生細(xì)菌共生特異性的因素[7]。還有研究表明，許多的植物內(nèi)生細(xì)菌具有宿主專一性特點(diǎn)，同一植物不同品種因環(huán)境或其他原因，也具有不同種類的內(nèi)生細(xì)菌，同種內(nèi)生細(xì)菌定殖寄主體內(nèi)和促進(jìn)寄主的生長的能力，也可能因同種植物不同的品種而有所差異[8]。基于此，本研究期望從耐鉛的小喬木紅葉石楠上分離純化出耐鉛的內(nèi)生細(xì)菌，為成功定殖在木本植物體內(nèi)并提高其耐鉛的能力打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

1.1.1 紅葉石楠

取自栽種于三明學(xué)院校門G205國道兩側(cè)綠化帶中紅葉石楠根莖葉3個部位，由于此路段有大量重型汽車行駛經(jīng)過且車流量較大，且汽車尾氣中的主要成分是含鉛化合物，所以此路段土壤在受到到汽車尾氣的長期污染下已存在鉛重金屬污染，而栽種的植株必定受到一定程度的鉛脅迫。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，其中鉛離子濃度依次為 0、0.3、0.6、0.9、1.2 mol/mL[6]。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化

紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌的分離方法參照本課題組小飛蓬耐鉛內(nèi)生細(xì)菌的分離方法[6]。

1.3 形態(tài)及生理生化鑒定

對分離純化的菌株進(jìn)行檸檬酸鹽反應(yīng)、VP試驗(yàn)、革蘭氏染色、甲基紅試驗(yàn)和接觸酶反應(yīng)等檢驗(yàn)[6]。

1.4 分子鑒定

菌株基因組DNA用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒V2.2進(jìn)行提取，以通用引物8f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 1492r（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）（上海華大基因）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。退火溫度為52℃。PCR產(chǎn)物為1 800 bp左右，用pMD19-T Vector連接PCR產(chǎn)物，挑取陽性克隆質(zhì)粒，送往杭州有康生物科技有限公司測序[6]。

測序后的序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫，BLAST比對分析，用Clustal X 1.83對同源性超過95%序列進(jìn)行分析，用軟件 MEGA（7.0）利用 Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)生菌的分離與純化

紅葉石楠表面滅菌處理的最后一遍無菌水涂布檢測分析，7 d后，沒有長出菌落，說明外植體表面消毒干凈。從不同鉛濃度的培養(yǎng)基上分離得到的細(xì)菌為內(nèi)生細(xì)菌，共分離純化出44株內(nèi)生細(xì)菌，其中在根、莖、葉的部位分別分離出17株、16株和11株（表 1）。

表1 紅葉石楠分離菌株情況

2.2 形態(tài)學(xué)與耐鉛生理濃度檢測

菌落為圓形，邊緣無鋸齒狀，乳白色，表面光滑。經(jīng)顯微鏡觀察，所有菌株革蘭氏染色結(jié)果均為G+菌，其菌株形態(tài)為桿狀和球狀。淀粉水解酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都為陽性（+），40株甲基紅試驗(yàn)測定結(jié)果為陰性（-），39株菌 VP試驗(yàn)結(jié)果為陽性（+），40株過氧化氫酶結(jié)果為陽性（+）（表2）。

表2 生理生化結(jié)果

2.3 內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA分子鑒定

根據(jù)細(xì)菌的形狀、甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)結(jié)果和過氧化氫實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提取S5、S11、S12、S13、S15、S16、S17、S22、S25和S43這些內(nèi)生細(xì)菌的DNA，擴(kuò)增各自的16S rDNA序列，并送去測序。測序分析結(jié)果表明，這些內(nèi)生細(xì)菌16SrDNA序列有3種，其中，S43為一種菌，S5、S12、S13和S25的16S rDNA序列相同，S11、S15、S16、S17和S22的16SrDNA序列相同。將這3段16S rDNA序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫，收集同源性高的序列。

利用MEGA（7.0）將紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌菌株與其同源性較高的菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹 （圖1）。從不同菌株的遺傳距離上進(jìn)行比較分析，初步推斷出S5為假單胞菌屬(Pseudomonas)，S17為蠟樣芽孢桿菌屬(Bacillus cereus)，S43為不動桿菌屬(Acinetobacter)。

2.4 討論

生長在重金屬污染的地區(qū)植物，隨著人類和動物的取食，積累在植物體內(nèi)的重金屬也會隨之進(jìn)入人類體內(nèi)，進(jìn)而危害人類的健康[10]。因此在重金屬污染的土壤修復(fù)過程中，應(yīng)避免可食用的植物如蔬菜和一些易被動物食用的草本植物用于重金屬污染土壤生物修復(fù)。大部分木本植物因?yàn)槠洳贿M(jìn)入食物鏈，在植物修復(fù)重金屬污染過程中將發(fā)揮重要的角色。

微生物與植物的共生關(guān)系促進(jìn)植物在鉛脅迫的條件下生長的現(xiàn)象，在小白菜[11]、扁豆[12]等植物上也有發(fā)現(xiàn)相類似情況。芽孢桿菌屬能幫助植物在重金屬離子脅迫下，產(chǎn)生生長激素如IAA等[13]，以利于植物生長。芽孢桿菌屬能幫助小白菜在鉛脅迫下，減少Pb的吸附量，以提高葉綠素含量，促進(jìn)植物生長[11]。不動桿菌和假單胞菌屬在Pb的脅迫下能產(chǎn)生出IAA等生長素，在植物某個部位、組織或結(jié)構(gòu)中生長素含量越多，對植物生長和吸收重金屬便越有利[14-16]。芽孢桿菌屬和假單胞菌屬可以溶解土壤中有機(jī)磷，促進(jìn)植物對磷的吸收[17]；假單胞菌屬具有ACC脫氨酶，能夠阻止植物產(chǎn)生乙烯，可以促進(jìn)植物根的生長[18]。因此推斷出這些內(nèi)生細(xì)菌與紅葉石楠的共生關(guān)系在一定程度上能防止鉛離子對其的傷害。

圖1 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本研究是以紅葉石楠根莖葉在含有不同鉛離子濃度的培養(yǎng)基中分離出耐鉛內(nèi)生細(xì)菌，共分離出44株耐鉛的內(nèi)生細(xì)菌，對所分離的菌株進(jìn)行生理生化分析，并通過16S rDNA序列的遺傳距離聚類分析等分子鑒定相結(jié)合的方法，將這些菌株分別歸為假單胞菌屬、蠟樣芽孢桿菌屬和不動桿菌屬。本研究為鉛污染地區(qū)土壤的微生物與植物聯(lián)合的生物修復(fù)提供了行之有效的技術(shù)理論基礎(chǔ)。