王炳然 張立平 郭子寧 彭 龍

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院東方醫(yī)院脾胃肝膽科，北京 100078

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是導(dǎo)致乙型肝炎（以下簡稱“乙肝“）的病原體。目前，全球約有3.64 億HBV 攜帶者[1]，其中15%～40%最終可能轉(zhuǎn)化為肝硬化和肝癌[2]。我國的肝硬化和肝癌患者中，由HBV 感染致病的比例分別約為60%和80%[3]。慢性乙肝的進(jìn)程及臨床結(jié)局主要取決于機(jī)體的免疫應(yīng)答，輔助性T 細(xì)胞（helper T cells，Th）發(fā)揮效應(yīng)是免疫應(yīng)答的重要環(huán)節(jié)，根據(jù)產(chǎn)生細(xì)胞因子的不同，Th 細(xì)胞可分為Th1、Th2 類細(xì)胞。研究表明：慢性乙肝患者存在明顯的Th1、Th2 類細(xì)胞失衡，并以Th2 類細(xì)胞優(yōu)勢表達(dá)為主[4-5]。近年來，中藥在慢性乙肝的防治上取得了較好的效果。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠及同系正常小鼠的外周血CD4+T、CD8+T 淋巴細(xì)胞所占比例，肝臟組織中白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-4 的含量，觀察扶正祛毒方對HBV 攜帶小鼠細(xì)胞免疫水平的調(diào)節(jié)，并對可能的機(jī)制加以探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

C57BL/6J 轉(zhuǎn)基因雄性小鼠30 只，同品系正常雄性小鼠10 只，周齡為（6±2）周，體重為（20±2）g，清潔級環(huán)境下飼養(yǎng)，溫度為22℃，相對濕度為60%，照明10 h/d。實(shí)驗(yàn)動物由北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0010。

1.1.2 藥物

扶正祛毒方：黃芪30 g、當(dāng)歸15 g、柴胡10 g、郁金10 g、半枝蓮15 g、白花蛇舌草15 g、蒲公英15 g、炙甘草6 g，劑型為配方顆粒，每袋8 g，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院配劑中心提供。根據(jù)人和動物體表面積計算公式換算后，加入生理鹽水配成濃度為0.12 g/mL的藥液。

阿德福韋酯片由葛蘭素史克（天津）有限公司生產(chǎn)。根據(jù)人和動物體表面積計算公式換算后，加入生理鹽水配成濃度為0.2 mg/mL 的藥液。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周后，將30 只HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為：模型組、中藥組、西藥組，每組各10 只，同系非HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠10 只為空白組。飼養(yǎng)及灌胃至24 周時，模型組死亡3 只，西藥組死亡2 只，中藥組及空白組無死亡。因模型組剩余7 只小鼠，故本實(shí)驗(yàn)按每組7 只統(tǒng)計數(shù)據(jù)，西藥組、中藥組、空白組均按隨機(jī)數(shù)表法選擇納入對象。模型小鼠表達(dá)的HBV 抗原來自受精卵時期的轉(zhuǎn)入基因，該基因整合于小鼠的染色體，可穩(wěn)定表達(dá)，且模型小鼠對HBV 抗原無免疫應(yīng)答[6]。

1.2.2 給藥方法

中藥組予扶正祛毒方藥液0.10 mL/（10 g·d）灌胃，西藥組予阿德福韋酯藥液0.08 mL/（10 g·d）灌胃，模型組及空白組均予生理鹽水0.10 mL/（10 g·d）灌胃，均為1 次/d。每周一稱重1 次，根據(jù)小鼠體重變化調(diào)整灌胃劑量。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T 最后1 次灌胃結(jié)束24 h 后，眶下取血加入抗凝管，加入DMEM，1200 r/min，離心半徑8 cm，5 min 洗1 次，加入5 mL 紅細(xì)胞裂解液，加入完全DMEM（CDMEM）10 mL 懸浮，洗1 次，再加入CDMEM 5 mL 懸浮，取50 μL 加入200 mL 的DMEM 中稀釋至5 倍，取臺盼藍(lán)與稀釋的細(xì)胞液1∶1混合，鏡下數(shù)對角線視野細(xì)胞數(shù)，計算所需細(xì)胞液總量。染色后取1×106個細(xì)胞入流式管，緩沖液1 mL 洗1 次。加入Fc Blocker 冰上作用5 min，加入熒光標(biāo)記的CD4、CD8 抗體冰上染色15 min。加緩沖液1 mL洗1 次，加300 μL 緩沖液，上機(jī)。

1.2.3.2 IL-2、IL-4 眶下取血后，斷頸椎處死小鼠，取肝臟組織研磨勻漿。檢測過程依據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（聯(lián)科生物試劑公司，批號：20170715）說明書進(jìn)行，以IL-2 為例簡要介紹操作方法：取肝組織300 mg離心10 min（離心半徑8 cm，轉(zhuǎn)速3000 r/min）去除沉淀物，稀釋所需試劑，制作血清樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線后檢測樣本：①用1×洗液清洗微孔板；②每孔加入50 μL的1×緩沖液；③復(fù)孔加入50 μL 的2 倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔復(fù)孔加入50 μL 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，樣本孔加入50 μL樣本；④每孔加入50 μL 稀釋的檢測抗體；⑤封板膜封板，300 r/min 振蕩，室溫孵育2 h；⑥棄掉液體，每孔加入300 μL 洗液，洗板6 次；⑦每孔加入100 μL 稀釋并標(biāo)記的鏈霉親和素；⑧封板膜封板，300 r/min 振蕩，室溫孵育45 min；⑨每孔加入100 μL 顯色底物，室溫孵育30 min；⑩每孔加入100 μL 終止液，顏色由藍(lán)變黃，用酶標(biāo)儀（Multiskan MK3，Thermo fisher 公司）測定450 nm 最大吸收波長和630 nm 參考波長下的吸光度（OD）值。計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的平均OD 值，減去零濃度標(biāo)準(zhǔn)品的OD 值；以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸擬合，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線并線性化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 20.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠外周血CD4+T、CD8+T 淋巴細(xì)胞比例及CD4+T/CD8+T 比較

中藥組CD8+T 淋巴細(xì)胞比例高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；模型組CD4+T/CD8+T 高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；西藥組和中藥組CD4+T/CD8+T 低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠外周血CD4+T、CD8+T 淋巴細(xì)胞比例及CD4+T/CD8+T 比較（）

表1 各組小鼠外周血CD4+T、CD8+T 淋巴細(xì)胞比例及CD4+T/CD8+T 比較（）

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05。CD8+T：CD8+T淋巴細(xì)胞；CD4+T：CD4+T 淋巴細(xì)胞

2.2 各組小鼠肝臟組織中IL-2、IL-4 含量比較

模型組IL-2 高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），中藥組IL-2 高于西藥組和模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）；模型組IL-4 高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；西藥組和中藥組IL-4低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠肝臟組織中IL-2、IL-4 含量比較（ng/mL，）

表2 各組小鼠肝臟組織中IL-2、IL-4 含量比較（ng/mL，）

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與西藥組比較，△P ＜0.05。IL：白細(xì)胞介素

3 討論

現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)認(rèn)為病毒性肝炎的病因病機(jī)是濕熱疫毒、飲食不潔、正氣虧虛[7]。其病機(jī)特點(diǎn)是濕、熱、疫毒伏于血分，常由外感邪氣、情志失暢、飲食勞倦等誘發(fā)[8]。目前將慢性HBV 攜帶歸屬為“疫毒”“疫病”范疇得到多數(shù)中醫(yī)學(xué)者的認(rèn)可[9]。本病的病位主要在肝，日久常涉及脾、腎、膽、胃等臟腑。病性多屬虛實(shí)夾雜，常伏而不發(fā)，耗傷正氣，或發(fā)為以“黃疸”“脅痛”為主癥的肝炎，或發(fā)為以“鼓脹”為特點(diǎn)的肝硬化、肝癌。“正虛毒伏”被多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為是慢性HBV 攜帶病機(jī)的關(guān)鍵[10]。正氣具有護(hù)衛(wèi)機(jī)體，抵御外邪的功能，其作用在一定程度上與免疫系統(tǒng)相類似。本病可遷延甚久，因此在治療時應(yīng)以扶正為本，重點(diǎn)調(diào)整臟腑、氣血、陰陽的平衡。

乙肝的嚴(yán)重程度主要取決于機(jī)體的免疫應(yīng)答[11]。HBV 不會直接損傷肝細(xì)胞，而是通過引起機(jī)體的免疫應(yīng)答，對肝細(xì)胞造成損傷[12]。HBV 的清除主要依靠特異性免疫。由特異性免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，結(jié)合相應(yīng)受體后調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長分化、調(diào)控免疫應(yīng)答，進(jìn)而清除HBV。Th 細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子發(fā)揮效應(yīng)，是免疫應(yīng)答的關(guān)鍵[13-14]。Th1 類細(xì)胞分泌以IL-2 為主的細(xì)胞因子，促進(jìn)巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞以及細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的增殖和分化，介導(dǎo)細(xì)胞免疫，清除HBV；Th2 類細(xì)胞分泌以IL-4 為主的細(xì)胞因子，刺激B 細(xì)胞增殖，介導(dǎo)體液免疫，抑制細(xì)胞免疫[15-16]。正常狀態(tài)下，Th1/Th2 保持相對平衡，當(dāng)發(fā)生HBV 攜帶時，Th1/Th2 的平衡則會發(fā)生“漂移”[17]，表現(xiàn)為Th1 類細(xì)胞功能減低，細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少，破壞病毒感染的靶細(xì)胞和抑制病毒復(fù)制的能力下降；同時，Th2 類細(xì)胞功能亢進(jìn)，進(jìn)一步抑制Th1 類細(xì)胞的應(yīng)答，逐漸形成對HBV 的免疫耐受，故Th1/Th2 失調(diào)可能是HBV 感染慢性化的主要機(jī)制之一[18]。因此，檢測肝組織中IL-2 和IL-4 含量能間接反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。

研究表明慢性HBV 攜帶小鼠的Th2 類細(xì)胞占優(yōu)勢，從而引起細(xì)胞免疫的低反應(yīng)狀態(tài)，導(dǎo)致免疫耐受[19]。本研究結(jié)果顯示，扶正祛毒方能夠影響Th 細(xì)胞的分化，改變Th1、Th2 類細(xì)胞的比例，使CD4+T 細(xì)胞向Th1類細(xì)胞分化，抑制IL-4 的表達(dá)，促進(jìn)IL-2 的表達(dá)及CD8+T 細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促使其分化為細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，發(fā)揮清除HBV 的作用?！秲?nèi)經(jīng)》有“邪之所湊，其氣必虛”“正氣存內(nèi)，邪不可干”的記載，強(qiáng)調(diào)了正氣在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。扶正祛毒方在清熱解毒的同時補(bǔ)益正氣，方中黃芪、當(dāng)歸益氣養(yǎng)血；柴胡、郁金疏肝行氣，宣暢氣血；蒲公英、半枝蓮、白花蛇舌草涼血解毒，軟堅散結(jié)；甘草調(diào)和諸藥，共奏養(yǎng)血理氣、清熱解毒之功[20-21]。中藥在治療慢性HBV 攜帶上能取得較好的效果，與中醫(yī)理論的整體觀念密不可分，在減少副作用的前提下起到治療作用，其臨床價值有待我們進(jìn)一步挖掘。