劉 君 馬秀麗 薛曉鷗

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院婦科，北京 100700；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院婦科，北京 100700

宮頸癌是目前全球范圍內(nèi)威脅女性生命健康的第四大惡性腫瘤[1]。有研究顯示，我國(guó)每年新發(fā)宮頸癌患者近10 萬，約有3 萬例患者因該病死亡[2]，發(fā)病年齡也逐步趨于年輕化。已經(jīng)證實(shí)，高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染是導(dǎo)致宮頸發(fā)生癌變的首要因素[3]。所以防治HPV 感染成為預(yù)防宮頸癌的重中之重，課題組的前期研究證實(shí)清熱除濕凝膠有較好的HPV 轉(zhuǎn)陰率，對(duì)HPV16 陽性的SiHa 細(xì)胞移植瘤的增殖有較好的抑制作用。本研究進(jìn)一步觀察藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠腫瘤組織線粒體凋亡蛋白表達(dá)的影響，以求能探究藥物發(fā)揮抑瘤作用的部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50 只4～5 周齡雌性BALB/c 裸小鼠，體重（15±1）g，SPF 級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司（SCXK 京2016-0006），飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（溫度：23～25℃，濕度：49%～51%）。實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號(hào)：BUCM-4-2019041002-2041。

1.2 細(xì)胞

HPV16 陽性人宮頸癌SiHa 細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

1.3 藥物、主要試劑與儀器

清熱除濕凝膠及凝膠中輔料卡波姆940 由百川飛虹技術(shù)有限公司生產(chǎn)提供。順鉑注射液（齊魯制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：8M0506B02），10 mg/支。上海翊圣生物科技的TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（瑞士羅氏生物公司，貨號(hào)：11684817910）；重組Anti-Bax，ab2503、Anti-Bcl-2，ab182858、Anti-Caspase-9，ab202068、Anti-Caspase-3，ab184787（美國(guó)Abcam 公司）；PVDF轉(zhuǎn)印膜（美國(guó)PALL，貨號(hào)：XLL092-2）；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑（美國(guó)PIERCE，貨號(hào)：ECL-0012）；MEM(EBSS)培養(yǎng)基（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所）；胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司，貨號(hào)：10099141）、0.25%EDTA 胰蛋白酶（美國(guó)Gibco 公司，貨號(hào)：25200056）。電泳儀DG-300C（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)儀ZS-3（北京市新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司）；迷你雙垂直電泳槽DYCZ-24DN、迷你轉(zhuǎn)印電泳槽DYCZ-40D（北京市六一儀器廠）；攝像裝置及成像軟件系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）。

1.4 方法

1.4.1 造模及分組 SiHa 細(xì)胞株經(jīng)過復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行凍存。造模前取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa 細(xì)胞，常規(guī)消化，用MEM（EBSS）=培養(yǎng)基重懸清洗，離心2 遍，1000 r/min，5 min（離心半徑157 mm），計(jì)數(shù)，制成濃度為2×107/mL 的細(xì)胞懸液，放置于冰上轉(zhuǎn)運(yùn)，備用。取雌性5 周齡裸小鼠，用1 mL 注射器抽取充分混勻的細(xì)胞懸液，注入裸小鼠右前腿外上方皮下，0.2 mL/只。細(xì)胞懸液注入后可見以注射部位為中心的圓形隆起，每天觀察記錄注射區(qū)域變化，以注射部位出現(xiàn)平均直徑≥0.5 cm 質(zhì)硬腫物為造模成功。成功后計(jì)算腫瘤體積大小，將腫瘤體積進(jìn)行編號(hào)，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表將荷瘤小鼠分為五組，每組10 只。即模型組、卡波姆940 組、中藥組、順鉑組及聯(lián)合用藥組（卡波姆為凝膠中的輔料，故設(shè)置該組）。

1.4.2 給藥 造模后，模型組常規(guī)飼養(yǎng)；中藥組于成瘤部位給予清熱除濕凝膠外涂（每天每50 mm3瘤體體積外涂凝膠0.3 mL）；順鉑組：將10 mg 順鉑溶于66.7 mL生理鹽水中制成順鉑注射液腹腔注射（每10 g 體重注射0.2 mL，每3 天注射1 次）；卡波姆940 組：卡波姆940 外涂（每天每50 mm3體積外涂0.15 mL）；聯(lián)合用藥組：同時(shí)給予中藥外涂和順鉑腹腔注射，方法劑量同前；各給藥組均給藥28 d。

1.4.3 取材及標(biāo)本制備 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取材前12 h 動(dòng)物禁食不禁水，1%戊巴比妥鈉0.1 mg/g，腹腔注射麻醉。剝?nèi)⌒∈蟮哪[瘤組織，稱重、拍照后，取1/2 組織分裝入凍存管，繼而放入液氮中保存，用于Western blot 蛋白檢測(cè)細(xì)胞凋亡檢測(cè)。另一部分放入甲醛中固定，用于后續(xù)其他實(shí)驗(yàn)。

1.5 結(jié)果判定

凋亡檢測(cè)：腫瘤組織切片經(jīng)脫蠟、酒精水化等處理后每片滴加100 μL 1×Equilibration Buffer（按1∶5 的比例用去離子TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒附帶）使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域，充分反應(yīng)后甩干，滴加緩沖液，進(jìn)入暗室，沖洗，滴加PI 溶液，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察剝離下的小鼠腫瘤組織切片（200×），染色為綠色的點(diǎn)為陽性細(xì)胞，隨機(jī)取5 個(gè)不重復(fù)的視野，對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI），AI（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

Western blot 蛋白檢測(cè)：取50～100 mg 腫瘤組織，加入RIPA 裂解液，冰上勻漿，4℃離心12 000 r/min，10 min，離心半徑6.2 cm。取上清，分裝，置于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲七m量BCA（A 液∶B 液=50∶1）工作液測(cè)定蛋白濃度，蛋白電泳（80 V 恒壓電泳）及轉(zhuǎn)膜（恒壓80 V轉(zhuǎn)移3 h）后分別按試劑說明書加入一抗和二抗（1∶2000 稀釋），檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3 蛋白。用Quantity One 圖像分析軟件讀取目標(biāo)條帶的光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較，采用LSD-t 或Dunnett’s 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分比表示。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物干預(yù)對(duì)腫瘤組織凋亡的影響

與模型組、卡波姆940 組比較，中藥組、順鉑組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率均有升高，以聯(lián)合用藥凋亡率最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；而卡波姆940 組與模型組細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖1～2。

圖1 藥物干預(yù)后各組腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況

圖2 藥物干預(yù)后各組腫瘤組織細(xì)胞免疫熒光TUNEL 凋亡圖（200×）

2.2 藥物對(duì)腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與模型組、卡波姆940 組比較，中藥組、順鉑組、聯(lián)合用藥組Bax、Caspase-3 表達(dá)均上調(diào)，Bcl-2 表達(dá)均下降，且聯(lián)合用藥組表達(dá)最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。與模型組、卡波姆940 組比較，順鉑組、聯(lián)合用藥組Caspase-9 表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3～4。

3 討論

宮頸癌嚴(yán)重威脅女性健康，是目前病因較清楚的女性惡性腫瘤，即與宮頸HPV 感染有關(guān)，尤其高危型HPV16 型和18 型致病風(fēng)險(xiǎn)最高[3]。諸多研究致力于尋找具有抑瘤作用或者抑制HPV 病毒的有效藥物從而防治宮頸癌。清熱除濕凝膠由紫草、金銀花、苦參、黃柏、莪術(shù)、白及等多味中藥組成，全方清熱除濕，斂瘡止帶，殺蟲止癢。方劑來源于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院名老中醫(yī)的治療宮頸炎癥的散劑經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)過本團(tuán)隊(duì)對(duì)藥味進(jìn)行加減優(yōu)化、劑型改良制成凝膠制劑，課題組前期經(jīng)過幾年的研究發(fā)現(xiàn)清熱除濕凝膠外用有較好的HPV 轉(zhuǎn)陰率，改善患者宮頸炎、宮頸HPV感染臨床癥狀、影響患者免疫功能；凝膠及其中部分單體成分體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛞种坡闶骃iHa 細(xì)胞移植瘤增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等多方面作用[4-10]。本研究對(duì)其體外促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及其機(jī)制進(jìn)一步研究。

圖3 藥物干預(yù)對(duì)腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4 藥物干預(yù)對(duì)腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自主性、程序性的死亡，正常凋亡能夠有效地清除基因異?；蛩ダ霞?xì)胞，是機(jī)體在細(xì)胞層面優(yōu)勝劣汰新陳代謝的過程。越來越多的研究證實(shí)腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖與凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破的結(jié)果，使一些該正常凋亡的細(xì)胞逃離凋亡，甚至過度增殖而成為腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞凋亡分為細(xì)胞表面受體的外部凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)在凋亡途徑[11]。本研究發(fā)現(xiàn)凝膠外涂能夠提高裸小鼠HPV16 陽性宮頸癌細(xì)胞移植瘤組織的細(xì)胞凋亡率，中藥組與模型組及其凝膠中輔料卡波姆940 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。而且清熱除濕凝膠外涂還能上調(diào)小鼠移植瘤腫瘤組織中線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9 水平，下調(diào)Bcl-2 水平。注射化療藥物順鉑也有此作用，且順鉑與中藥外涂聯(lián)合用藥作用最強(qiáng)。考慮中藥凝膠發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與線粒體內(nèi)在凋亡途徑有關(guān)。線粒體凋亡途徑是Bcl-2 蛋白家族、半胱氨酸蛋白酶（Caspase 家族）及線粒體膜結(jié)構(gòu)變化等諸多環(huán)節(jié)共同構(gòu)成的一個(gè)復(fù)雜的凋亡網(wǎng)絡(luò)[12]。在細(xì)胞凋亡信號(hào)的誘導(dǎo)下，線粒體外膜通透性發(fā)生改變或者被破壞，使本身在線粒體內(nèi)的物質(zhì)如細(xì)胞色素C（CytC）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）、核酸內(nèi)切酶G 等穿過線粒體膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致線粒體功能的喪失，細(xì)胞凋亡程序啟動(dòng)，隨后引起一些列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中CytC 對(duì)線粒體損傷最為嚴(yán)重，使線粒體迅速喪失功能，最終引起Caspase 的活化，使DNA 降解，細(xì)胞凋亡[13-15]。Bax/Bcl-2 家族以及Caspase 系列蛋白是線粒體凋亡途徑中的重要凋亡相關(guān)蛋白。Bax為促凋亡蛋白代表，Bcl-2 為抑凋亡蛋白代表。Bcl-2/Bax 比值改變被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡逃逸的主要機(jī)制[16-17]。Caspase 是觸發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白家族，也是線粒體凋亡途徑的重要參與者[18]，上游凋亡始動(dòng)因子Caspase-9和下游凋亡效應(yīng)因子Caspase-3 是其中相對(duì)重要的蛋白酶，在其他Caspase 凋亡輔助因子輔助下參與細(xì)胞凋亡過程。已有研究證實(shí)宮頸癌及癌前病變組織中的Bcl-2 表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織[19]，且能通過促進(jìn)Caspase-3 表達(dá)而達(dá)到抑制宮頸癌細(xì)胞增殖作用[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)清熱除濕凝膠能上調(diào)腫瘤組織中促凋亡蛋白Bax，下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2，從而進(jìn)一步影響Caspase 家族，上調(diào)了Caspase-9 和Caspase-3，使腫瘤細(xì)胞凋亡率升高，這可能是藥物發(fā)揮抑瘤作用和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的部分機(jī)制。

凝膠中的藥物成分多數(shù)為具有清熱燥濕、清熱解毒、殺蟲止癢斂瘡作用的中藥。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)清熱類中藥能夠影響腫瘤性疾病的細(xì)胞凋亡[22-25]，為本研究中藥的作用提供佐證和研究支持，對(duì)藥物進(jìn)一步研究開發(fā)和藥味拓展也奠定一定基礎(chǔ)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)與中藥組和順鉑組比較，中藥與順鉑聯(lián)合作用，其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、上調(diào)促凋亡蛋白Bax 下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2 的作用均最強(qiáng)，提示中藥與順鉑有協(xié)同增效作用，與相關(guān)研究的結(jié)論類似[26]。藥物的具體機(jī)制和與抗腫瘤西藥的聯(lián)合作用等尚有待于更深層次的進(jìn)一步研究。