張洋洋，崔麗麗，余燕敏

湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 襄陽 441053

惡性腫瘤是一類威脅人類生命健康，且治療難度極大、治療成本較高、治療過程漫長、治愈率極低的的疾病。據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會(huì)（National Health Commission，RPC）統(tǒng)計(jì)的最新數(shù)據(jù)［1］，目前惡性腫瘤已成為我國城市居民致死的首位疾病。并且世界衛(wèi)生組織（WHO）預(yù)測，2030 年全球與癌癥相關(guān)的死亡人數(shù)將高達(dá)1320 萬［2］。惡性腫瘤死亡率高，主要?dú)w因于缺乏有效的早期診斷、預(yù)測及有效的臨床方案。早診斷、早治療，目前是降低惡性腫瘤病死率的最有效手段。研究證實(shí)，肺癌早期診斷可將患者的生存率提高23 倍［3-4］。食管癌的早期發(fā)現(xiàn)并用內(nèi)鏡切除術(shù)治療可使病人的五年生存率高達(dá)95%［5］。胃癌和大腸癌的早期診斷和治療可使患者的生存率高達(dá)90%以上［6-7］。

目前較常用的惡性腫瘤臨床早期診斷方式主要有：滴血芯片檢測、基因檢測、活組織檢查、納米試劑以及醫(yī)學(xué)影像學(xué)檢查技術(shù)電子計(jì)算機(jī)斷層掃描CT、B 超、磁共振MRI 等診斷方法。每一種檢測方法都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，如滴血芯片檢測成本低，但靈敏度低，特異性較差；基因檢測靈敏度高，精確度高，但成本高；影像學(xué)檢查無創(chuàng)，但對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高，早期診斷率較低。發(fā)展低成本、精準(zhǔn)的、微或無創(chuàng)的癌前診斷技術(shù)一度成為研究者研究熱點(diǎn)。碳量子點(diǎn)（CDs）合成前驅(qū)物多元化且成本低、水溶性好、生物相容性好、細(xì)胞無毒或低毒性、高靈敏、高特異性、高準(zhǔn)確性、熒光壽命長等特性［8-17］，使其成為成本低的、精準(zhǔn)的、無創(chuàng)的癌前診斷技術(shù)的最佳選擇。本文著重介紹了碳量子點(diǎn)應(yīng)用于細(xì)胞成像的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展，并對碳量子點(diǎn)在惡性腫瘤早期診斷中的挑戰(zhàn)進(jìn)行了分析與展望，探索其作為診斷治療一體化試劑的應(yīng)用前景。

1 碳量子點(diǎn)的性質(zhì)

1.1 碳量子點(diǎn)的熒光穩(wěn)定性

2004 年，Xu等［18］通過弧光放電法由碳灰制備單壁碳納米管（SWCNTs），在分離純化時(shí)，在懸浮液中有可發(fā)熒光的碳納米粒子，但其產(chǎn)率僅有10%。2006 年，Sun 等［19］應(yīng)用激光剝離法合成產(chǎn)率較高且熒光較強(qiáng)的碳納米顆粒，并首次命名為碳點(diǎn)即碳量子點(diǎn)。碳量子點(diǎn)在特定波長激發(fā)下，可發(fā)強(qiáng)熒光，熒光性能穩(wěn)定，量子產(chǎn)率可高達(dá)99%［20］。Yan 等［21］將碳量子點(diǎn)放在在氙燈下450 W 的條件下照射2 h，間隔20 min 測熒光強(qiáng)度，結(jié)果表明碳量子點(diǎn)的強(qiáng)度并未發(fā)生變化。丁媛媛等［22］制備的橘色熒光碳量子點(diǎn)（N-CDs）在氙燈照射100 min 和在紫外燈180 min后，其熒光強(qiáng)度分別為最初強(qiáng)度的93%和91.5%。Shi等［23］以烏龍茶為碳源合成的碳量子點(diǎn)可以呈現(xiàn)亮綠色的熒光，且在不同濃度的氯化鈉溶液中表現(xiàn)出較好的光學(xué)穩(wěn)定性。陳清愛等［24］以檸檬酸為碳源，采用油浴加熱法制備碳量子點(diǎn)，將合成的碳量子點(diǎn)和異硫氰熒光素在紫外燈下照射1 h 后，碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度基本不變，而異硫氰熒光素的熒光強(qiáng)度明顯降低，然后將碳量子點(diǎn)低溫保存30天，發(fā)現(xiàn)碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度幾乎并沒有發(fā)生變化，說明碳量子點(diǎn)具有較好的抗光漂白性。熒光碳量子點(diǎn)克服了傳統(tǒng)有機(jī)熒光試劑的熒光強(qiáng)度不穩(wěn)定和易被光漂白的缺點(diǎn)，其獨(dú)特的熒光性能使其可能成為新一代熒光探針的材料［25］。

1.2 碳量子點(diǎn)的表面易修飾

碳量子點(diǎn)表面分布有含氧官能團(tuán)，為其表面修飾提供了有利的條件［26-27］。Mao 等［28］研究表明，表面修飾后的碳量子點(diǎn)熒光得到增強(qiáng)且壽命變長。楊佩等［29］研究證實(shí)，表面修飾可有效提高碳量子點(diǎn)的靶向作用，碳量子點(diǎn)（TAT-CD-PEG）和葉酸（FA）修飾的碳量子點(diǎn)TAT-CD-PEG-FA 標(biāo)記宮頸癌細(xì)胞，因?qū)m頸癌細(xì)胞膜表面的葉酸受體，TAT-CD-PEG-FA 比TAT-CD-PEG 更容易進(jìn)入宮頸癌細(xì)胞內(nèi)完成熒光標(biāo)記。Fu 等［30］通過水熱法合成碳量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率為18%，經(jīng)氮、硫修飾的碳量子點(diǎn)量子產(chǎn)率高達(dá)35.2%，修飾可有效提高碳量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率。Atchudan等［31］以未成熟桃為碳源合成的氮摻雜的碳量子點(diǎn)量子產(chǎn)率較未摻雜氮的量子產(chǎn)率高。表面修飾的碳量子點(diǎn)可降低細(xì)胞毒性。Chandra 等［32］以蔗糖為碳源合成碳量子點(diǎn)與人的紅細(xì)胞共孵育，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，表面氨基化的碳量子點(diǎn)可降低碳量子點(diǎn)對細(xì)胞的毒性。碳量子點(diǎn)易于表面修飾的特性為“精準(zhǔn)醫(yī)療”的實(shí)現(xiàn)，提供了光明的前景［33］。

1.3 碳量子點(diǎn)的生物相容性和細(xì)胞毒性

傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)由于有重金屬毒性，即使在低濃度下仍具有很大的毒性，限制了其在生物成像方面的應(yīng)用［34］，良好的生物相容性和低細(xì)胞毒性是碳量子點(diǎn)應(yīng)用于生物成像的 前提條件。碳量子點(diǎn)是一種以碳元素為核心區(qū)域的納米材料，碳元素本身具有良好的生物相 容性［35］。劉歡等［36］以葡萄糖為碳源合成的碳量子點(diǎn)，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)碳量子點(diǎn)濃度為1 mg/ml 時(shí)，有超過90%的宮頸癌細(xì)胞存活，當(dāng)其濃度高達(dá)5 mg/ml 時(shí)，宮頸癌細(xì)胞的存活率仍高于60%。Song 等［37］通過比較未修飾的CdTe量子點(diǎn)、Au納米顆粒和碳量子點(diǎn)對細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示，碳量子點(diǎn)對宮頸癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞基本沒有毒性，表現(xiàn)出良好的生物相容性。Yang 等［38］將合成的碳量子點(diǎn)以生物成像所需濃度注射到小鼠的體內(nèi)，一段時(shí)間后，觀察到小鼠并沒有中毒的現(xiàn)象。張現(xiàn)峰等［39］以草酸和尿素為原料合成碳量子點(diǎn)，Macairan 等［40］以甲酰胺和谷胱甘肽為原料合成的碳量子點(diǎn)，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)也證明了碳量子點(diǎn)具有低細(xì)胞毒性和良好的生物相容性。

2 碳量子點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞成像中的應(yīng)用

基于碳量子點(diǎn)的強(qiáng)熒光，易修飾，生物相容性好和低細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)，醫(yī)學(xué)上已經(jīng)將其應(yīng)用于細(xì)胞成像和抗腫瘤藥物中。1998 年，Chan 等［41］首次將量子點(diǎn)進(jìn)行表面功能化并成功應(yīng)用到細(xì)胞成像領(lǐng)域，拉開了量子點(diǎn)在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的序幕。

2.1 乳腺癌細(xì)胞成像中的應(yīng)用

2007年，Cao等［19-42］最早把碳量子點(diǎn)運(yùn)用到生物成像領(lǐng)域，他們通過簡單的激光燒蝕法以石墨粉和水泥為原料，聚丙酰亞胺-共亞胺作為表面鈍化劑合成表面修飾的碳量子點(diǎn)。用制備的CQDs 與體乳腺癌細(xì)胞MCF-7 細(xì)胞一起培養(yǎng)2 h 后，一定激發(fā)波長下在共聚焦熒光顯微鏡觀察到MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)發(fā)出明亮的綠色熒光（圖1），證實(shí)碳量子點(diǎn)沒有進(jìn)入細(xì)胞核。

圖1 共聚焦熒光顯微鏡下碳量子點(diǎn)在MCF-7細(xì)胞內(nèi)的成像情況

Pan等［43］以檸檬酸甲酰胺溶液為原料，利用微波法合成平均尺寸約為6.8 nm 的激發(fā)依賴性碳量子點(diǎn)（F-CDs），MCF-7細(xì)胞的體外毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)-CDs 對細(xì)胞毒性低。并將一定量的F-CDs 加入活細(xì)胞和固定細(xì)胞中，培養(yǎng)一段時(shí)間后，用熒光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的熒光情況，發(fā)現(xiàn)在不同的激發(fā)波長下，MCF-7細(xì)胞中呈現(xiàn)不同顏色的熒光，猜測在固定細(xì)胞和活細(xì)胞中，F(xiàn)-CDs 分別通過擴(kuò)散作用和胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，并且熒光幾乎存在整個(gè)細(xì)胞區(qū)域，由此推測F-CDs不僅可以進(jìn)入進(jìn)入細(xì)胞膜，還可以進(jìn)入細(xì)胞核中，這將有利于腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物的研究。Yao等［44］合成去鐵蛋白（AFn）和葉酸（FA）修飾的含有釓的碳量子點(diǎn)（Gd-CDs/AFn/FA）對MCF-7 細(xì)胞具有靶向作用，被標(biāo)記的細(xì)胞可以發(fā)出獨(dú)特的綠色熒光，并且對細(xì)胞幾乎無毒性，包裹鹽酸阿霉素（DOX）的Gd-CDs/AFn/FA 對腫瘤細(xì)胞的生長有抑制作用，在腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)揮著巨大的潛力。

Fan 等［45］以PEG 為碳源合成黃色的碳量子點(diǎn)溶液，此碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度具有pH 依懶性，并且在生理鹽水溶液中其熒光強(qiáng)度并不隨溶液濃度增加而變化，在熒光顯微鏡下，碳量子點(diǎn)標(biāo)記的MCF-7 細(xì)胞可以發(fā)出明亮的熒光。郝麗英等［46］合成的氮化碳量子點(diǎn)/鹽酸阿霉素/殼聚糖@靶向適配體（C3N4/DOX/Cs@AS1411），對正常細(xì)胞無毒，對MCF-7 細(xì)胞具有熒光特異性，其可以作為MCF-7 細(xì)胞多模式治療的藥物。

2.2 肺腺癌細(xì)胞成像中的應(yīng)用

Wang 等［47］合成聚醚酰亞胺和葉酸修飾的碳量子點(diǎn)（CDots-PEI-FA），并研究CDots-PEI-FA 在肺腺癌細(xì)胞成像中的應(yīng)用。Wu 等［48］通過水熱合成法，以蠶絲作為碳源，氫氧化鈉為鈍化劑，合成量子產(chǎn)率達(dá)13. 9%的含氮碳量子點(diǎn)，采用CKK-8 法對細(xì)胞毒性進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果顯示含氮碳量子點(diǎn)對細(xì)胞幾乎沒有毒性，用共聚焦熒光顯微鏡在不同的通道可觀察到大部分碳量子點(diǎn)可以通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核，并且在不同的通道激發(fā)下，被碳量子點(diǎn)標(biāo)記的肺腺癌細(xì)胞呈現(xiàn)出不同的顏色，見圖2。

圖2 碳量子點(diǎn)標(biāo)記A549 細(xì)胞在不同的通道激發(fā)下成像a:明場成像; b，c，d分別為被CY3，GFP457和DAPI染色后成的像

Yang［49］等以殼聚糖為碳源，不需要表面鈍化劑，在180℃溫和的條件下， 通過水熱碳化法制備了高氨基化的熒光碳量子點(diǎn)，合成的量子點(diǎn)的產(chǎn)率約為7.8%。MTT法測定細(xì)胞的活力和細(xì)胞毒性，結(jié)果表明碳量子點(diǎn)具有良好的細(xì)胞相容性和低細(xì)胞毒性，在共聚焦顯微鏡下觀察到發(fā)光區(qū)域主要在肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核幾乎不發(fā)光，與Cao［42］的研究結(jié)果相一致，說明碳量子點(diǎn)作為生物成像材料的有著很好的應(yīng)用前景。

陳文新等［50］以廢棄的干燥碾碎的甘蔗渣粉末為碳源，利用水熱法一步合成熒光碳量子點(diǎn)，熒光光譜分析結(jié)果顯示，該碳量子點(diǎn)具有多元激發(fā)和多元發(fā)射的熒光性。肺腺癌細(xì)胞體外細(xì)胞毒性研究顯示，碳量子點(diǎn)具有低細(xì)胞毒性，細(xì)胞生物相容性良好，并且在熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，碳量子點(diǎn)表現(xiàn)出良好的熒光標(biāo)記的性質(zhì)。李陽等［51］利用水熱法以檸檬酸為碳源，以乙二胺為輔助劑，合成羧基化的碳量子點(diǎn)（CDs-COOH）。并通過酰胺反應(yīng)阿霉素的氨基與羧基化的碳量子點(diǎn)中的羧基結(jié)合，合成CDs-DOX 載藥碳量子點(diǎn)，肺腺癌細(xì)胞的MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CDs-DOX 有一定的細(xì)胞毒性，說明CDs-DOX 具有一定的體外抗腫瘤的作用。

2.3 宮頸癌細(xì)胞成像中的應(yīng)用

劉歡等［36］以葡萄糖為碳源合成碳量子點(diǎn)，并將合成的碳量子點(diǎn)成功運(yùn)用在宮頸癌細(xì)胞成像中。Qian 等［52］以對苯二酚為原料，四氯化硅為修飾劑合成含硅的碳量子點(diǎn)對宮頸癌細(xì)胞表現(xiàn)出低毒性。Zhou 等［53］以西瓜皮為原料合成的碳量子點(diǎn)，在488 nm 激發(fā)波長的刺激下，被標(biāo)記的宮頸癌細(xì)胞可以發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光（圖3）。

Wang 等［54］以檸檬酸為碳源，SiO2 為載體，氨丙基三甲氧基硅烷（APS）為輔助劑采用水熱法合成SiO2@CDs，以葉酸（FA）為表面修飾劑，共價(jià)結(jié)合、真空干燥合成量子產(chǎn)率足夠高的SiO2@CDs-FA 固體粉末。采用共聚焦顯微鏡技術(shù)研究SiO2@CDs-FA 是否對癌細(xì)胞有選擇性地識(shí)別作用，結(jié)果顯示與正常細(xì)胞（293T細(xì)胞）相比，宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光，表明SiO2@CDs 可以用于宮頸癌的早期診斷。

圖3 碳量子點(diǎn)和Hela 細(xì)胞共孵育后的共聚焦顯微鏡圖像（λex=488 nm）

王忠瑞等［55］通過微波法以甘油為碳源，聚多巴胺為輔助劑，一步合成呈藍(lán)綠色的碳量子點(diǎn)溶液，再將四價(jià)鉑前藥、N-羥基琥珀酸酰亞胺（NHS）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）放入碳量子點(diǎn)溶液中，充分?jǐn)嚢?、冷凍干燥后得到碳量子點(diǎn)-四價(jià)鉑前藥納米粒子，宮頸癌細(xì)胞內(nèi)定位研究發(fā)現(xiàn)，碳量子點(diǎn)-四價(jià)鉑前藥納米粒子在宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞核中均可以被發(fā)現(xiàn)，且其抗腫瘤細(xì)胞活性的能力明顯優(yōu)于目前臨床的抗腫瘤的藥物。

楊佩等［29］采用水熱法以檸檬酸為碳源，乙二胺為表面鈍化劑，制備碳量子點(diǎn)溶液，為了得到共價(jià)修飾的碳量子點(diǎn)，用羥基化的碳量子點(diǎn)修飾聚乙二醇（PEG），核定位肽TAT和葉酸（FA），得到了TAT-CD-PEG和TAT-CD-PEG-FA。將TAT-CD-PEG 和TAT-CD-PEG-FA 分別與宮頸癌細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，宮頸癌細(xì)胞更容易內(nèi)吞葉酸修飾的碳量子點(diǎn)，核定位肽TAT 修飾的碳量子點(diǎn)，使碳量子點(diǎn)具有細(xì)胞核靶向的功能。該生物功能化的碳量子點(diǎn)具有粒徑小，低細(xì)胞毒性，易于表面修飾和細(xì)胞核靶向功能的優(yōu)點(diǎn)，可以運(yùn)用于細(xì)胞內(nèi)成像和宮頸癌治療藥物的定向運(yùn)輸。

Pan 等［56］合成的含釓碳量子（GCDs）點(diǎn)，通過宮頸癌細(xì)胞和小鼠細(xì)胞成像，證明GCDs 可以作為雙模式生物成像應(yīng)用的材料。Zhang等分別在2017年［57］和2018年［58］合成的FA-GdN@CQDs-MWCNTs 和SWCNTs-PEG-Fe3O4@CQDs 兩種納米材料對宮頸癌細(xì)胞具有靶向作用，其經(jīng)過表面的修飾，在雙模態(tài)熒光/磁共振成像中得到了運(yùn)用。

2.4 其它癌細(xì)胞成像中的應(yīng)用

李曉峰等［59］合成的氮摻雜碳量子點(diǎn)在肝癌細(xì)胞（HepG2 細(xì)胞）成像中得到了運(yùn)用，并呈現(xiàn)出多波長成像的現(xiàn)象。Guan 等［60］將制備的Man-CDs-liposome 標(biāo)記HepG2細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察，通過圖4能夠看出熒光區(qū)域主要在HepG2細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核的周圍也有較弱的熒光，由圖4（b，c）可知，被Man-CDs-liposome 標(biāo)記的HepG2 細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)大于被CDs-liposome 標(biāo)記HepG2細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，這是由于HepG2細(xì)胞表面的存在甘露醇受體，甘露醇通過與甘露醇受體特異性地結(jié)合，使大量的Man-CDs-liposome被HepG2細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

圖4 CDs、CDs-liposome 和Man-CDs-liposome 與HepG2 細(xì)胞共同孵育48小時(shí)之后的熒光共聚焦顯微鏡照片

Jaiswal 等［61］以聚乙二醇為原料和鈍化劑通過微波法合成碳量子點(diǎn)，將合成的碳量子點(diǎn)與大腸腺癌（HT29 細(xì)胞）共培養(yǎng)，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察，HT29 細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光，而對照組的細(xì)胞沒有出現(xiàn)藍(lán)色熒光。研究者們也報(bào)道了碳量子點(diǎn)在其它癌細(xì)胞中的成像中的應(yīng)用，如腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12 cells）［62］、埃利希氏腹水癌細(xì)胞［63］、胃癌細(xì)胞［64］、人骨肉瘤細(xì)胞（MG-63 細(xì)胞）［65］等，均證明了碳量子點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞成像中有很好的應(yīng)用前景。

3 總結(jié)與展望

作為一種新型碳納米材料，碳量子點(diǎn)的粒徑小，低毒性等諸多優(yōu)點(diǎn)使其應(yīng)用前景廣闊。在生物成像研究過程中，碳量子點(diǎn)替代傳統(tǒng)半導(dǎo)體量子點(diǎn)的優(yōu)異性逐漸被研究人員發(fā)現(xiàn)，且碳量子點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用為惡性腫瘤的早期診斷和治療提供了更加廣闊的發(fā)展方向和空間。盡管目前碳量子點(diǎn)的研究成果顯著，但碳量子點(diǎn)的性質(zhì)和功能仍存在一定的局限性。（1）雖然碳量子點(diǎn)的低細(xì)胞毒性和良好的生物相容性通過大量的實(shí)驗(yàn)被證實(shí)，但已報(bào)道的碳量子點(diǎn)的受試動(dòng)物種類單一，其在生物體內(nèi)成像的應(yīng)用仍需要深入的研究。（2）目前碳量子點(diǎn)的合成產(chǎn)率大多數(shù)是較低的，合成綠色環(huán)保且高熒光產(chǎn)率的碳量子點(diǎn)仍是今后研究的熱點(diǎn)。（3）對碳量子點(diǎn)的表面進(jìn)一步改性可擴(kuò)大碳量子點(diǎn)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，今后實(shí)驗(yàn)人員可制備表面修飾且能靶向不同的特定腫瘤細(xì)胞的碳量子點(diǎn)，并研究碳量子點(diǎn)進(jìn)入不同腫瘤細(xì)胞的最適濃度。隨著對碳量子點(diǎn)的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和探索，碳量子點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞早期診斷的應(yīng)用優(yōu)勢會(huì)逐漸表現(xiàn)出來，并不斷研發(fā)新的診療手段，使碳量子點(diǎn)在惡性腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用日漸完善，最終使其應(yīng)用于臨床研究中。