馮久芳，謝瑩霞

1.商丘市食品藥品檢驗檢測中心，河南 商丘 476000；2.商丘市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南 商丘 476001

復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿是一種中西藥復(fù)方制劑，其顏色為紅棕色，性狀較為稠厚，氣味芬芳，口感甜，主要用于兒童營養(yǎng)不良及維生素缺乏癥［1-2］。方中含有較多種類的B 族維生素與中藥提取物。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對維生素B1 和維生素B6 進行了質(zhì)量控制，其他有效成分不能得到有效控制。有研究指出，復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿的處方成分較為復(fù)雜，是一種由10余種中藥提取物混合制成的維生素制劑，同時也由于B 族維生素結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且容易受到外界因素影響，易出現(xiàn)降解而影響藥物的療效，因此針對于該制劑中的維生素做更深一步的質(zhì)量控制是極為重要的。目前國內(nèi)針對于此類藥物的報道多是僅僅針對其中一種或者兩種維生素的含量進行測定，或者采用多種方式對于藥物中的不同維生素進行測定，處理方式復(fù)雜，其檢驗結(jié)果也往往受到多種客觀因素的影響，很難對此類藥物的維生素含量與質(zhì)量進行全面的評價［3］。本文采用高效液相色譜法，對制劑中的四種維生素同時測定，方法簡便，易于操作，為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提供了有利的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），XS205DU型電子分析天平（梅特勒托利多儀器（上海）有限公司），KQ400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

維生素B1 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100390-201505，含量為97.0%）、維生素B2 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100369-201504，含量為98.2%）［2］、維生素B6 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100116-201404，含量為100%）和煙酰胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100115-201604，含量為99.9%）乙腈、甲醇（德國Merek 公司）均為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純，復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿（國藥控股星鯊制藥有限公司，批號：20960901，20960902，20960903，20961001，20960603）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Betasil C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-5 mmol/L 十二烷基硫酸鈉（含0.05% 甲酸）水（B）溶液；流速1.0 mL/min，檢測波長260 nm，柱溫30 ℃，進樣量20 μL；梯度洗滌時間、流動相比例［3-5］，見表1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備：分別取維生素B1、B2、B6 和煙酰胺對照品適量，精密稱定，置同一25 mL 量瓶中，加0.05 %甲酸：10 %甲醇（1：1）混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備質(zhì)量濃度分別為576、116、172 和576 μg/mL的維生素B1、B2、B6 和煙酰胺混合溶液作為對照品溶液［3］。

2.2.2 供試品溶液的制備：精密量取供試品5 mL，置于具塞錐形瓶中，加0.05 %甲酸：10 %甲醇（1：1）混合溶液10 mL，超聲處理20 min，將溶液轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，加上述溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液［4］。

2.2.3 陰性對照溶液的制備：除維生素B1、B2、B6 和煙酰胺外，其他各藥按處方量投料按復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿的制備工藝制成陰性對照，然后按供試品的制備方法，制成陰性對照溶液［5］。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果表明四種維生素的峰型良好，分離度達到要求，陰性對照溶液在與對照品主峰的相應(yīng)位置無干擾。

表1梯度洗滌時間、流動相比例

圖1 混合對照品溶液（A）、樣品溶液（B）和陰性對照溶液（C）的HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系

分別稱取維生素B1、B2、B6 和煙酰胺對照品適量，精密稱定，置同一25 mL量瓶中，加0.05 %甲酸：10 %甲醇（1：1）混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，遵循2.2.1 對照品溶液的制備步驟，制備5.76、11.53、23.05、28.89、57.5、115.2 μg/mL 質(zhì)量濃度的維生 素B1，1.16、2.33、4.65、5.9、11.5、23.20 μg/mL 質(zhì) 量 濃 度 的 維 生 素B2，1.72、3.43、6.87、8.5、17.1、34.4 μg/mL 質(zhì)量濃度的維生素B6，5.76、11.53、23.04、28.7、57.8、115.2 μg/mL 質(zhì)量濃度的煙酰胺等一系列混合對照品溶液。精密量取對照品系列溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀進行測定，記錄峰面積積分值［6］。以對照品濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰值面積均值Y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。結(jié)果表明四種維生素的線性關(guān)系良好。

表2 4種成分的線性關(guān)系曲線

2.5 加樣回收率

精密量取一系列混合供試品溶液進行樣測定，分別計算各濃度梯度待測成分的加樣回收率，見表3。

3 樣品測定

5 個批次的復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿（精準(zhǔn)量取5.0 mL）按照2.2.2供試品溶液的制備步驟制備供試品溶液，分別對樣20 μL 的測定峰面積進行記錄和含量進行計算，具體數(shù)值見表4。

表3 加樣回收率研究分析

表4 樣品含量測定分析

4 討論

4.1 色譜柱、測定波長、提取溶劑的選擇

本文按照試驗方法對維生素B1、B2、B6 和煙酰胺4種維生素含量進行測定，Thermo Betasil C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）通過對C18 的鍵位進行特殊極性加工，可有效利用各維生素的疏水相互作用、極性相互作用等化學(xué)性質(zhì)差異，準(zhǔn)確的分離和高效的保留極性維生素化合物；260 nm檢測波長通過影響檢測試劑的信號產(chǎn)生及大小，可直接產(chǎn)生各維生素成分含量的色譜圖，具有基線穩(wěn)定，識別度高；0.05%甲酸＋10%甲醇提取溶劑（1:1，pH 3.2）在有效調(diào)節(jié)溶液酸度的同時，通過較大的極性萃取樣品中各維生素成分，且萃取含量極高［7］。

4.2 流動相的優(yōu)化

按照試驗方法對混合供試品溶液和混合對照品溶液的色譜流動相進行分析，發(fā)現(xiàn)乙腈-酸水體系在維生素B1、B2、B6 色譜分離中分離度良好，而煙酰胺分離中存在保留時間長、色譜峰拖尾現(xiàn)象嚴重等問題［8］。因此，可加入適量的甲醇溶液減少色譜分離中各成分的保留時間，抑制拖尾、裂峰現(xiàn)象，改善峰形。

4.3 樣品測定結(jié)果分析

本文對5 個批次復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿進行多次試驗方法進行分析，測得樣品中維生素B1、B2、B6 和煙酰胺的含量范圍分別為0.133 8～0.148 2，0.027 8～0.028 9，0.039 0～0.045 1 和0.138 6～0.143 1 mg/g，分別進行加標(biāo)回收試驗，測得平均回收率取值范圍為97.45%～98.42%、97.71%～98.42%、96.69%～98.11%和96.21%～97.99%。

綜上所述，本試驗采用高效液相色譜法通過色譜柱、測定波長、提取溶劑的選擇和流動相的優(yōu)化，操作簡便、精準(zhǔn)、重復(fù)性佳的完善了臨床對復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿中四種維生素含量的測定，為該制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，增加了質(zhì)量控制的科學(xué)性。