林秀山 周向東 王才春

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海口 570102)

支氣管哮喘是呼吸道常見的慢性疾病，氣道阻力增高以及高反應(yīng)性是其顯著特征[1-2]。越來越多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，哮喘發(fā)作與大氣PM2.5濃度有明顯相關(guān)關(guān)系，這種相關(guān)關(guān)系的發(fā)生機制十分復(fù)雜，表觀遺傳學(xué)(甲基化)的變化可能參與其中[3-4]。叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(fork head/winged helix transcription factor，F(xiàn)OXP3)是CD+CD25+Treg細(xì)胞表面的特異性信號分子，參與調(diào)控Treg細(xì)胞的形成與功能發(fā)揮[5]，而TH1/TH2功能失衡是哮喘發(fā)病的重要機制，基于以上理論，課題組質(zhì)疑FOXP3基因的甲基化可能參與了哮喘的發(fā)生以及發(fā)展。因此，本研究選取了50只SD大鼠為研究對象，構(gòu)建哮喘模型并進(jìn)行不同濃度PM2.5干預(yù)，探討PM2.5暴露對哮喘大鼠氣道形態(tài)及FOXP3基因DNA啟動子區(qū)甲基化的影響。

1 材料與方法

1.1 PM2.5采集與處理

采用大流量顆粒采集裝備，在早高峰及晚高峰時的繁華路口持續(xù)采集24 h。將采樣后的濾膜進(jìn)行切割、浸水后恒溫振蕩，洗脫后過濾，低溫凍存；在真空中進(jìn)行冷凍干燥處理，當(dāng)水分完全蒸干時，容器底部可見呈灰白色絮狀物的PM2.5顆粒。根據(jù)實驗設(shè)計，采用生理鹽水將PM2.5顆粒配置成1、5、25 mg/mL的懸浮液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實驗動物模型建立及分組

50只SPF雄性SD大鼠(4～6周齡)，體質(zhì)量(203±15)g，購于四川大學(xué)實驗動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(川)2013-026。根據(jù)干預(yù)措施及劑量的不同，將大鼠分為(1)對照組：給予與致敏劑同等劑量的生理鹽水進(jìn)行腹腔注射。(2)哮喘組：在實驗的第1天，在大鼠大腿內(nèi)側(cè)皮下注射OVA懸液1 mL(卵清蛋白10 mg、氫氧化鋁200 mg)進(jìn)行致敏，同時腹腔注射百日咳桿菌懸液1 mL作為佐劑，在第8天、第15天各重復(fù)一次。大鼠出現(xiàn)典型激惹癥狀及肺組織出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤視為造模成功。(3)低劑量組：致敏方法同哮喘組。氣管滴注PM2.5顆粒物懸液1.5 mg/kg體質(zhì)量，3 d/次，共5次。(4)中劑量組：致敏方法同哮喘組。氣管滴注PM2.5顆粒物懸液6 mg/kg，3 d/次，共5次。(5)高劑量組：致敏方法同哮喘組。氣管滴注PM2.5顆粒物懸液24 mg/Kg，3 d/次，共5次。

1.3 肺泡灌洗液收集及肺組織切片

對大鼠進(jìn)行動脈采血后處死，仰臥固定四肢，暴露胸腔，游離結(jié)扎左主支氣管，在環(huán)狀軟骨上方向右支氣管插入注射器，注射5 mL生理鹽水，灌洗2次，收集約10 mL灌洗液。低溫保存，2000 r/min離心15 min，收集上清，低溫凍存。對離心后的沉淀進(jìn)行重懸、稀釋，在顯微鏡下用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計算。細(xì)胞沉淀涂片，干燥固定，染色后計數(shù)200個白細(xì)胞進(jìn)行分類計算。處死大鼠并收集灌洗液后，取左肺下葉，用甲醛固定24 h后，石蠟包埋，切片約5 μm，進(jìn)行HE染色。

1.4 RT-qPCR檢測

采用TRlzol法提取肺組織中的RNA，采用β-action作為內(nèi)參基因，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，利用SYBGGreen試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。引物序列如下，

正向：GGCAAACGGAGTCTGCAAG，

反向：TGCTCCAGAGACTGCACCAC。

反應(yīng)條件為，50 ℃ 2min，95 ℃變性15 s、30 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。基因相對表達(dá)水平采用2-△△Ct法確定。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量變化

隨著實驗的延長，實驗組大鼠攝食量減少，體質(zhì)量增長速度減緩，毛發(fā)干枯豎立、無光澤，煩躁不安，易激惹，被激惹時有頻繁點頭、端坐呼吸等表現(xiàn)。與對照組相比，所有實驗組大鼠的體質(zhì)量均明顯較低(P<0.05)，與哮喘組相比，低、中、高劑量干預(yù)組的體質(zhì)量均明顯較低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化

2.2 各組大鼠臟器系數(shù)比較

5組大鼠的左肺指數(shù)、心臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均存在明顯差異(P<0.05)，兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量干預(yù)組的左肺指數(shù)及心臟指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，但脾臟指數(shù)與對照組及哮喘組無明顯差異(P>0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞計數(shù)比較

與對照組比，哮喘組的細(xì)胞總數(shù)升高顯著，低、中劑量干預(yù)組明顯升高(P<0.05)，高劑量干預(yù)組無明顯變化(P>0.05)。與對照組及哮喘組比較，隨著PM2.5干預(yù)劑量的升高，大鼠BALF內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計數(shù)呈逐漸上升趨勢，巨噬細(xì)胞呈逐漸下降趨勢，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2 各組大鼠臟器系數(shù)比較

表3 各組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞計數(shù)比較

2.4 各組大鼠肺組織HE染色

與對照組相比，哮喘組大鼠肺組織有明顯的炎性細(xì)胞浸潤，氣道壁增厚。低劑量組炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇，并出現(xiàn)肺泡間隔斷裂，正常結(jié)構(gòu)破壞。中劑量組管腔內(nèi)分泌物進(jìn)一步增多，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。高劑量組出現(xiàn)大量杯狀細(xì)胞增生，正常肺泡結(jié)構(gòu)少見，支氣管上皮皺襞有斷裂的趨勢，少量細(xì)胞出現(xiàn)壞死，見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色

2.5 FOXP3基因DNA啟動子區(qū)甲基化及FOXP3 mRNA檢測結(jié)果

將陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對倍稀釋，對濃度取對數(shù)后作X軸，CT值為Y軸，可得FOXP3基因陽性對照標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-1.39ln(x)+28.37=5,R2=0.996。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組、哮喘組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的FOXP3基因DNA啟動子區(qū)的甲基化水平分別為(7.24±0.91)、(5.04±3.08)、(1.87±1.46)、(1.57±0.64)、(2.04±1.14)，F(xiàn)OXP3 mRNA相對表達(dá)量分別為(1.02±0.18)、(0.81±0.19)、(0.62±0.15)、(0.53±0.14)、(0.32±0.04)，隨著PM2.5干預(yù)劑量的提高，大鼠的FOXP3基因DNA啟動子區(qū)的甲基化水平及FOXP3 mRNA相對表達(dá)量均逐漸降低。

3 討論

PM2.5是指環(huán)境空氣中直徑≤2.5 μm的細(xì)小顆粒物，它能長時間在空氣中懸浮，雖然在大氣成分中含量很少，但會顯著影響空氣質(zhì)量和能見度，且PM2.5顆粒徑小，相對面積大，易附帶有毒有害物質(zhì)，對人體健康會造成明顯的不良影響[6]。我國罹患哮喘的人口基數(shù)大，相關(guān)的醫(yī)療負(fù)擔(dān)十分沉重[7]。其發(fā)病機制復(fù)雜，環(huán)境因素、遺傳因素、生活習(xí)慣因素都參與了其中。PM2.5可明顯促進(jìn)哮喘等呼吸道疾病的發(fā)生發(fā)展，TH1/TH2功能失衡是重要機制，而FOXP3是調(diào)控Treg 細(xì)胞發(fā)育及啟動抑制功能的關(guān)鍵基因，在近年來的研究中越來越受到重視[8-9]。

在本研究中，我們通過OVA懸液激發(fā)建立大鼠哮喘模型，隨著實驗的延長，大鼠攝食量減少，體質(zhì)量增長速度減緩，毛發(fā)干枯豎立、無光澤，煩躁不安，易激惹，被激惹時有頻繁點頭、端坐呼吸等表現(xiàn)，與文獻(xiàn)報道一致[10-11]。進(jìn)一步行收集大鼠肺泡灌洗液，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后發(fā)現(xiàn)，哮喘組的細(xì)胞總數(shù)升高最顯著，但高劑量干預(yù)組無明顯變化。隨著PM2.5干預(yù)劑量的升高，大鼠BALF內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計數(shù)也呈逐漸上升趨勢，巨噬細(xì)胞呈逐漸下降趨勢。這表明大鼠哮喘模型建立成功。

Treg細(xì)胞分為天然型(nTreg)和誘導(dǎo)型(iTreg)兩大類，參與調(diào)控免疫反應(yīng)，對及時調(diào)整過度免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)起著關(guān)鍵作用[12]。FOXP3是CD+CD25+Treg細(xì)胞表面的特異性信號分子，參與調(diào)控Treg細(xì)胞的形成與功能發(fā)揮，對哮喘炎癥有明顯的緩解作用[13-14]。Coman等[15]將Treg細(xì)胞導(dǎo)入哮喘大鼠模型后，對肺組織進(jìn)行染色后發(fā)現(xiàn)，嗜酸性粒細(xì)胞比例及TH2型細(xì)胞因子分泌量均顯著下降，羅征秀等[16]報道稱，與正常兒童相比，哮喘患兒痰液中的FOXP3+Treg 細(xì)胞比例明顯降低。在本研究中，我們采用敏感度較高的PCR法檢測了肺組織中FOXP3基因DNA啟動子區(qū)甲基化及FOXP3 mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著PM2.5干預(yù)劑量的提高，大鼠的FOXP3基因DNA啟動子區(qū)的甲基化水平及FOXP3 mRNA相對表達(dá)量均逐漸降低。這表明，F(xiàn)OXP3基因啟動子區(qū)的甲基化程度隨著病情程度的加重，呈逐漸降低趨勢，但相對而言，F(xiàn)OXP3 mRNA的表達(dá)水平受影響程度較小。我們推測，可能的原因有：(1)FOXP3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制復(fù)雜，可能還受其他信號通路的影響。(2)本研究為動物實驗，與人類基因研究存在種屬差異性。(3)本研究中的甲基化引物是根據(jù)基因啟動子區(qū)位點設(shè)計的，不能完全排除此位點的特異性。但實驗中FOXP3基因的總體變化趨勢與預(yù)想一致，表明隨著哮喘的加重，F(xiàn)OXP3的基因表達(dá)量會受到明顯抑制，這與其他研究者的結(jié)論相同。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5對哮喘大鼠的損傷有一定的劑量依賴性，這可能與調(diào)低基因FOXP3基因DNA 啟動子區(qū)甲基化水平及FOXP3 mRNA相對表達(dá)量有關(guān)。