蔡珠明，黨光輝，臧鑫鑫，邵明珠，唐陽陽,2，崔子寅，宋寧寧，劉思國*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動物細(xì)菌病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林 長春 130118）

副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis，MAP）是胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性病原菌，也稱禽分枝桿菌副結(jié)核分枝桿菌亞種，屬于禽分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium avium complex，MAC）成員，為致病性的非結(jié)核分枝桿菌[1]，基于全基因組測序的系統(tǒng)進(jìn)化分析，將MAP 分為3 種亞型，即C 型（牛型）、S 型（羊型）和B 型（野牛型）[2]。MAP 主要引起反芻動物的副結(jié)核病（Paratuberculo?sis，pTB），又稱約內(nèi)氏?。↗ohne's disease，JD），為一種慢性、接觸性腸道增生性傳染病，潛伏期長，臨床表現(xiàn)為持續(xù)性腹瀉、體重迅速減輕，并最終導(dǎo)致消耗性死亡[2]，該病嚴(yán)重威脅著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。奶牛主要通過接觸感染牛的乳汁或糞便感染[3-4]。在兔、狐貍、白鼬和鼬鼠等許多非反芻野生動物中也能分離到MAP[5]。自從1913 年Dalziel 等首次描述牛約內(nèi)氏病與人類克羅恩?。–rohn's dis?ease，CD）的相似性以來[6]，MAP 感染與克羅恩病的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。Martin 等通過28 個病例對照研究證實(shí)了MAP 與克羅恩病之間具有特定關(guān)聯(lián)[7]。因此對于pTB 的流行病學(xué)研究勢在必行。

2019 年5 月，本研究從黑龍江某規(guī)?；霾杉?5 頭患副結(jié)核牛的直腸刮取物，通過PCR 鑒定和MAP 的分離培養(yǎng)，結(jié)果表明31 份為MAP 感染，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步病原學(xué)和分子流行病學(xué)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料樣品及菌株黑龍江某牛場副結(jié)核病抗體陽性牛的直腸刮取物樣品35 份。禽分枝桿菌（Mycobacterium avium subsp. Avium，MAA）-血清II 型（CVCC276）購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；胞 內(nèi) 分 枝 桿 菌（Mycobacterium intracellulare，MI，ATCC13950）購 自ATCC；MAP K-10（ATCC BAA-968）參考菌株由本實(shí)驗(yàn)保存。

1.2 主要試劑氯代十六烷基吡啶（HPC）、萘啶酮酸鈉鹽（Naladixicacid）、萬古霉素、兩性霉素B 均購自美國Sigma-Aldrich 公司； 腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）、Herrold's Egg Yolk Agars、7H9 液體培養(yǎng)基均購自美國BD 公司；分枝桿菌素購自美國Allied Mon?itor 公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、糞便基因組DNA 提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；Premix ExTaq DNA Polymerase 和PrimeSTAR Max DNA Polymerase 均 購 自TaKaRa 公 司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成參照文獻(xiàn)[8]合成檢測IS900、IS901、DT1、IS1311、16S rRNA 的多重PCR引物，由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 直腸刮取物樣品的PCR 檢測及細(xì)菌的分離培養(yǎng)稱取直腸刮取物樣品5 g～8 g，加35 mL 滅菌水震蕩混勻，300 r/min 室溫離心5 min 后將上清再次離心5 min，取2 mL 上清室溫12 000 r/min 離心15 min后保留上清用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)，沉淀采用糞便基因組DNA 提取試劑盒提取總基因組。以提取的基因組DNA 為模板、MAP K-10 的基因組為陽性對照、滅菌水為陰性對照，采用IS900 引物進(jìn)行PCR 鑒定，反應(yīng)程序如下：95 ℃5 min；95 ℃60 s、60 ℃40 s、72 ℃35 s，30 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 擴(kuò)增陽性的樣本用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)，采用改良的NADC 法[9]，將PCR 結(jié)果為陽性的樣品上清處理后取0.1 mL 懸液接種于Herrold's Egg Yolk Agars 的斜面培養(yǎng)基上。

1.5 分離菌的多重PCR 鑒定挑取Herrold's Egg Yolk Agar 培養(yǎng)基上的單菌落接種于7H9 液體培養(yǎng)基（10% OADC，0.2% Tween-80，0.05%甘油，2 mg/L Mycobactin J）中，100 r/min 搖床37 ℃培養(yǎng)28 d。收集5 mL 菌體用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取基因 組。以IS900、IS901、DT1、IS1311 和16S rRNA 5 對引物進(jìn)行多重PCR 鑒定。反應(yīng)程序：95 ℃8 min；95 ℃59 s、60 ℃40 s、72 ℃35 s，30 個循環(huán)；72 ℃10 min。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 分離菌MAP 的遺傳進(jìn)化分析及亞型鑒定采用IS1311 引物，利用PrimeSTAR 聚合酶對提取的分離株MAP 基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃10 s； 98 ℃10 s、60 ℃5 s、72 ℃5 s，30 個循環(huán)，72 ℃1 min。PCR 產(chǎn)物純化后由吉林省庫美生物有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站采用BLAST 進(jìn)行同源性比對，利用MegAlign 軟件進(jìn)行MAP IS1311 基因序列核苷酸同源性分析并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。利用Snapgene 軟件查找分析酶切位點(diǎn)，參照Godfroid 等報(bào)道的MAP-IS1311 多態(tài)性的分型方法[10]，查找PCR 產(chǎn)物—IS1311 基因上的酶切位點(diǎn)，對鑒定為MAP 的菌株進(jìn)行亞型鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 直腸刮取物樣品的PCR 檢測與MAP 的分離培養(yǎng)從35 份MAP 血清抗體陽性牛的直腸刮取物樣品中提取基因組，經(jīng)IS900-PCR 鑒定后，顯示31 份為陽性（圖1A），表明有31 頭奶牛向外排菌。造成檢測結(jié)果差異的原因如下：其一是由于牛處于MAP 感染的早期，僅有抗體升高，還沒有向外排菌；其二是直腸刮取物中MAP 菌體數(shù)量太少，由于PCR 敏感性問題無法檢測到；其三是ELISA 結(jié)果出現(xiàn)假陽性結(jié)果。兩種檢測方法的互為補(bǔ)充提示在以后的流行病學(xué)調(diào)查中要同時(shí)檢測抗體和抗原以確保檢測的準(zhǔn)確性。將鑒定為陽性的樣品，處理后接種于Herrold's Egg Yolk Agars 培養(yǎng)基上，30 d 后，觀察到編號為HLJB160、HLJB175 和HLJB177 樣品的培養(yǎng)基上長出菌落，起初（40 d）觀察到呈點(diǎn)狀分布、乳白色半透明，邊緣平滑有光澤的小菌落，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌落變大，直至培養(yǎng)至100 d 觀察到菌落由半球狀轉(zhuǎn)為乳頭狀（圖1B）。從31 份PCR 陽性的直腸刮取物樣品中總共分離培養(yǎng)出3 株MAP，分離率為9.7%（3/31）。31 份經(jīng)IS900鑒定為陽性的樣品中僅3份有菌落生長，這是由于MAP 對生長條件有著非?？量痰囊?，在體外分離培養(yǎng)的過程中需要依賴分枝桿菌素的作用維持其生長，同時(shí)菌量的多少、直腸采樣的深淺及直腸刮取物中復(fù)雜的雜菌污染等給MAP的分離帶來了挑戰(zhàn)[11]，這可能是本次分離株少的主要原因。

2.2 分離菌的多重PCR 鑒定結(jié)果將3 株分離菌挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)28 d 后利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取基因組，以5 對鑒定引物進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，3 株分離菌均擴(kuò)增得到約398 bp、484 bp 和608 bp 的3 條目的條帶，分別與IS900、16S rRNA、IS1311 3 個基因片段的大小一致，擴(kuò)增條帶與MAP K-10標(biāo)準(zhǔn)株相一致（圖2）。結(jié)果表明3株分離菌均為MAP，將它們分別命名為MAP-HLJB160、MAPHLJB175、MAP-HLJB177。多重PCR方法相較于分離培養(yǎng)方法更加快捷，并且在分枝桿菌檢測中具有靈敏度更高、特異性更強(qiáng)的特點(diǎn)，本結(jié)果是對前文結(jié)論的進(jìn)一步論證和支持。

圖1 直腸刮取物PCR 鑒定結(jié)果（A）和分離株的生長情況（B）Fig. 1 Rectal scrape PCR identification results (A) and the growth of isolate strains (B)

圖2 副結(jié)核分枝桿菌分離株多重PCR 鑒定結(jié)果Fig. 2 Identification of the MAP isolates by multiplex PCR

2.3 MAP 分離菌的遺傳進(jìn)化分析及亞型鑒定結(jié)果對3 株MAP 分離菌的IS1311 PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站采用BLAST 進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示3 株MAP 分離菌IS1311 基因序列之間100%同源，利用MegAlign 軟件進(jìn)行MAP IS1311 基因序列同源性分析，結(jié)果顯示IS1311 基因序列與GenBank 中的多個MAP 相應(yīng)基因序列同源性在99.8%以上，構(gòu)建該基因遺傳進(jìn)化樹結(jié)果顯示，HLJB160、HLJB175 和HLJB177 與CP015495.1（MAP/TANUVAS/印度/2008）、CP033911.1（MAPK_JB16/15/韓國/2018）和CP005928.1（MAP4/美國/2014）等多株MAP 在遺傳進(jìn)化上具有高度的親緣性。利用Snapgene 軟件查找到3 株分離菌均含有牛型MAP 特有的兩個Hinf I（218 位和285 位）酶切位點(diǎn)（圖3B），與Godfroid 等報(bào)道的牛型MAP 特征相一致，表明本實(shí)驗(yàn)分離的MAP-HLJB160、MAPHLJB175、MAP-HLJB177均為牛型MAP。

圖3 分離菌MAP 的遺傳進(jìn)化分析及亞型鑒定結(jié)果Fig. 3 Genetic evolution analysis and subtype identification of MAP isolates

國內(nèi)外均有MAP 分離鑒定的報(bào)道。Grant 等從犢牛的代乳粉中分離得到MAP 并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析[12]。Galiero 等在意大利北部的野生馬鹿中分離得到19株MAP，全部是牛型，并進(jìn)行了基因分型研究[13]。Marina 等首次從巴西的山羊中分離出MAP 菌株，并鑒定屬于牛型MAP[14]。彭永等對山東省75頭ELISA陽性牛的糞便樣品分離培養(yǎng)，共分離到4 株MAP，IS1311 特異性片段驗(yàn)證及雙酶切分型鑒定確定4 株分離菌均為羊型MAP[15]。

對MAP 準(zhǔn)確的分離與鑒定是后續(xù)對其進(jìn)行一系列分子水平研究的前提。本實(shí)驗(yàn)分離鑒定得到3 株牛型MAP，對黑龍江某牛場的牛群健康狀況進(jìn)行了考察，為該場之后對該疫病的防控提供參考。