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        豬塞尼卡病毒VP2 ELISA 抗體檢測方法的建立及初步應(yīng)用

        2021-01-22 02:59:20周而璇延君芳
        關(guān)鍵詞:豬場陰性抗體

        周而璇,范 慧,延君芳,姜 平,白 娟

        (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室,江蘇 南京 210095)

        塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA),最早稱為塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus SVV)。中文名有塞內(nèi)卡病毒、塞內(nèi)加病毒和塞尼卡病毒。SVA 屬于小RNA 病毒科塞內(nèi)卡病毒屬成員,2002 年Hales 等首次發(fā)現(xiàn)于PER.C6(人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞)細(xì)胞,并發(fā)現(xiàn)該病毒具有溶解人類腫瘤作用[1]。2008 年以來,加拿大和美國等西方國家先后報道該病毒感染引起的豬臨床疾病,包括成年豬口腔和鼻腔潰瘍、厭食、爛足、仔豬嗜睡、虛弱、發(fā)熱和嘔吐等[2-5]。該病毒感染主要影響育肥豬和新生仔豬,1日齡~4日齡仔豬發(fā)病率可達(dá)到70%,死亡率15%~30%;母豬發(fā)病率可達(dá)到70%~90%,但死亡率僅0.2%[6-8]。2015 年,我國廣東省證實(shí)豬群存在該病,且SVVCH-01-2015 分離株與國外病毒株基因同源性為94.4%~97.1%[9]。此后,有學(xué)者相繼報道我國多地出現(xiàn)該病。本實(shí)驗室從山東省某臨床發(fā)病豬群也分離獲得該病毒[10]。

        該病毒抗體檢測方法主要有間接ELISA、競爭ELISA、間接免疫熒光試驗(IFA)和病毒中和試驗等。ELISA 方法采用的包被抗原有VP1、VP2、VP3和3AB 蛋白等[10-13]。VP2-ELISA 方法的敏感性和特異性分別為94.2%和89.7%,優(yōu)于VP1 和VP3 抗原ELISA 方法,與IFA 符合率為89%[12]。病毒中和試驗的特異性和敏感性分別為99.6%和98.2%[13]。本研究采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得VP2 純化重組蛋白,通過條件優(yōu)化,建立了VP2 間接ELISA 抗體檢測方法,并用于規(guī)?;i場血清流行病學(xué)調(diào)查,表明2016 年~2019 年我國多個省份廣泛存在該病毒感染,為我國該病防控提供了重要流行病學(xué)資料。

        1 材料與方法

        1.1 病毒與血清SVA SVV-CH-SD 株由本實(shí)驗室分離和保存;SVA VP2 單克隆抗體(MAb)和120 份SVA 陽性血清(采自SVV-CH-SD 株攻毒豬,且中和試驗鑒定為陽性)由本實(shí)驗室制備和保存;70 份SVA 陰性血清采自臨床健康豬,且中和試驗鑒定為陰性;口蹄疫病毒(FMDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)和豬偽狂犬病毒(PRV)陽性血清,均由本實(shí)驗室保存。

        2 182 份臨床豬血清,為2016 年~2019 年收集自江蘇、安徽、浙江、山東和江西等省份規(guī)?;i場臨床血清,-40 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 主要試劑pET-32a(+)、E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗室保存;HRP 標(biāo)記的金黃色葡萄球菌A 蛋白(HRP-SPA)購自博士德生物技術(shù)有限公司;TMB 顯色液、限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶購自TaKaRa 公司;ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Pierce 公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自Biomiga 公司;BSA 牛血清白蛋白購自Sigma-Aldrich 公司;96 孔酶標(biāo)板購自Corning 生物科技有限公司。

        1.3 引物設(shè)計與合成根據(jù)SVACH-02-2015 株VP2基因序列(KX173339.1)利用Primer5.0 軟件設(shè)計一對引物,預(yù)期擴(kuò)增片段長度為852 bp:SVA-VP2-F:5'- CGCGGATCCGATCACAATACCGAAGAAATGGAAA ACTCTGC-3'/SVA-VP2-R:5'-ATACTCGAGCTGTTC CTCGTCCGTCCCG-3',下劃線分別為BamH I 和Xho I酶切位點(diǎn)。引物由金斯瑞生物技術(shù)有限公司委托合成。

        1.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化提取SVA SVVCH-SD 株RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以其為模板,采用針對VP2 基因PCR 引物擴(kuò)增VP2 基因,PCR 產(chǎn)物純化回收后克隆至pET-32a(+)載體,獲得重組質(zhì)粒pET-32a-VP2,經(jīng)酶切和測序鑒定正確后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。37 ℃震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期后,加入終濃度為1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)5 h。菌液離心后,收集菌體,用15 mL PBS 重懸,超聲裂解并離心后,分別收集上清和沉淀,采用SDSPAGE 分析蛋白表達(dá)形式。將獲得的重組蛋白用Ni柱純化處理,以SVA VP2 MAb(1∶200)為一抗,山羊抗鼠Ig-HRP(1∶1 000)為二抗,western blot 鑒定VP2 蛋白與SVA 血清的反應(yīng)原性。大量制備獲得純化重組VP2 蛋白,經(jīng)BCA 法測定蛋白濃度,-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

        1.5 間接ELISA 反應(yīng)條件優(yōu)化采用方陣滴定法分別對間接ELISA 的VP2 蛋白抗原包被濃度(4 μg/mL、3 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL)、血清稀釋度(1∶50、1∶100、1∶200、1∶400)、包 被 時 間(4 ℃過 夜、37 ℃孵育2 h+4 ℃過夜、37 ℃孵育1 h+ 4 ℃過夜)、封閉試劑(5% BSA、1% BSA、5%脫脂乳)、封閉時間(3 h、2 h、1 h)、血清作用時間(30 min、45 min、60 min)、HRP-SPA 稀 釋 度(1∶5000、1∶10 000、1∶15 000)和反應(yīng)時間(30 min、45 min、60 min)、TMB顯色時間(4 min、6 min、8 min、10 min、12 min、14 min、16 min),進(jìn)行優(yōu)化,以P/N 值(陽性血清OD450nm/陰性血清OD450nm)最大時的反應(yīng)條件為ELISA的最佳反應(yīng)條件。

        1.6 ELISA 陰陽性臨界值的確定采用上述優(yōu)化的ELISA 方法檢測70 份SVA 抗體陰性的臨床豬血清樣品,設(shè)定SVA 陰陽性血清對照,測定各血清的OD450nm值。計算S/P 值,S/P=(樣品血清OD450nm值-陰性血清OD450nm值)/(陽性血清OD450nm值-陰性血清OD450nm值)。計算S/P 值平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(-X 和SD)。按照S/P 值≥-X +3SD 時為判定血清抗體陽性,S/P 值<-X +2SD 時為陰性;介于兩者之間判為可疑。

        1.7 特異性試驗利用本實(shí)驗已建立的ELISA 方法對FMDV、PRRSV、PCV2、CSFV、PRV 陽性血清抗體進(jìn)行檢測,以SVA 陽性血清為陽性對照,SVA 陰性血清為陰性對照,檢測該方法的特異性。

        1.8 敏感性試驗選取120 份SVA 陽性血清,用PBS 做1∶100 稀釋,采用優(yōu)化的VP2 間接ELISA 方法檢測,測定OD450nm,根據(jù)S/P 值判定血清抗體陰陽性,計算陽性血清檢出率,分析該方法敏感性。

        1.9 重復(fù)性試驗批內(nèi)重復(fù)試驗采用同批包被抗原的ELISA 酶標(biāo)板對5 份抗體水平不同的豬SVA 陽性血清進(jìn)行檢測,重復(fù)3 次試驗。批間重復(fù)試驗采用3 批抗原包被的酶標(biāo)板,分別檢測5 份抗體水平不同的豬SVA 陽性血清SVA 抗體,計算S/P 值及其變異系數(shù)。

        1.10 符合率比較試驗選取112 份臨床豬血清樣本(從SVA 豬場隨機(jī)采集),參照FMDV 微量血清中和試驗(SN/T 1181.2-2003)進(jìn)行血清SVA 中和試驗(SN),中和抗體效價<1∶4 判定為陰性,≥1∶4 為陽性,同時利用建立的SVA 間接ELISA 方法檢測這112 份豬血清。結(jié)果判定以SN 試驗為標(biāo)準(zhǔn),分析兩種方法符合率。符合率(%)=[(陽性數(shù)+陰性數(shù))/檢測總數(shù)]×100%。

        1.11 華東地區(qū)豬SVA 流行病學(xué)調(diào)查利用本實(shí)驗建立的VP2 間接ELISA 檢測方法對2016 年~2019 年度我國華東地區(qū)江蘇、浙江、山東、安徽、江西等地2 070 份血清進(jìn)行檢測,每個樣品重復(fù)3 次,取其OD450nm平均值,分析華東地區(qū)SVA 的流行狀況。

        2 結(jié) 果

        2.1 目的基因克隆、表達(dá)與純化以SVA 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板,PCR 擴(kuò)增獲得大小為852 bp的VP2 基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-VP2,目的基因測序正確。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞,IPTG 誘導(dǎo)后,經(jīng)SDS-PAGE 檢測,重組菌pET-32a-VP2/DE3 經(jīng)誘導(dǎo)后在55 ku 出現(xiàn)目的條帶(圖1A)。表明目的蛋白獲得了表達(dá),且主要以包涵體的形式存在,制備獲得純化重組蛋白大小約55 ku,west?ern blot 結(jié)果顯示在55 ku 處出現(xiàn)特異條帶(圖1B),表明重組VP2 蛋白具有反應(yīng)原性。

        圖1 SVA VP2 重組蛋白SDS-PAGE(A)和western blot(B)鑒定Fig. 1 SDS-PAGE(A) and western blot(B) identification of SVA VP2 recombinant protein

        2.2 間接ELISA 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果采用方陣滴定法確定了重組VP1 蛋白包被濃度和待檢血清稀釋倍數(shù),在此基礎(chǔ)上對其他各個反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示最佳反應(yīng)條件為:抗原最佳包被濃度為1 μg/mL,37 ℃孵育2 h 后4°過夜;5%脫脂乳溶液37 ℃封閉3 h;待檢血清1∶100 稀釋,37 ℃反應(yīng)30 min,HRP-SPA 1∶15 000 稀釋,37 ℃作用30 min,加入TMB 顯色液,37 ℃避光顯色10 min,最后測定OD450nm值。

        2.3 臨界值的確定利用該方法檢測70 份陰性豬血清,平均OD450nm值為0.228,陽性對照平均OD450nm為1.034。S/P 平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為-X=0.053,SD=0.059。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理,S/P(樣本)≥-X+3SD=0.227時為陽性,S/P(樣本)<-X+2SD=0.171 時為陰性,介于兩者之間時判為可疑(圖2)。

        圖2 SVA VP2 ELISA 抗體陰性血清正態(tài)分布分析Fig. 2 Analysis of the negative serums against SVA VP2 with ELISA

        2.4 特異性試驗結(jié)果利用該方法檢測5 種豬病原抗體陽性血清,結(jié)果均為陰性(表1),表明該蛋白與FMDV、PRRSV、PCV2、CSFV 和PRV 陽性血清抗體均無交叉反應(yīng),SVA 陰陽性對照均成立。表明該方法特異性較強(qiáng)。

        表1 SVA VP2 間接ELISA 方法特異性試驗結(jié)果Table 1 SVA VP2 indirect ELISA method specific test results

        2.5 敏感性試驗結(jié)果取120 份SVA 人工感染豬SVA 抗體陽性血清,采用本研究建立的ELISA 方法檢測,結(jié)果有110 份血清抗體陽性,陽性血清檢出率為91.6%。表明該方法敏感性較高。

        2.6 重復(fù)性試驗結(jié)果選擇5 份豬血清分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)檢測3 次,結(jié)果顯示,批內(nèi)重復(fù)試驗變異系數(shù)為3.12%~11.1%,批間變異系數(shù)為2.98%~9.67 %,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于12%(表2),表明該方法具有較好的重復(fù)性。

        2.7 符合率試驗結(jié)果利用本研究建立的間接ELI?SA 和SN 試驗同時檢測112 份臨床豬血清樣本,結(jié)果顯示,兩種方法的符合率為91.9%(表3)。表明該方法與SN 試驗符合率較高。

        圖3 敏感性試驗結(jié)果Fig. 3 Sensitivity test results

        表2 SVA VP2 間接ELISA 方法重復(fù)性試驗結(jié)果Table 2 SVA VP2 indirect ELISA method repeatability test

        表3 SVA VP2 間接ELISA 抗體檢測方法與SN 試驗結(jié)果比較Table 3 Comparison of SVA VP2 indirect ELISA antibody detection method and SN test results

        2.8 華東五省份血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果采集2016年~2019 年華東地區(qū)5 省份規(guī)模豬場血清2 070 份,采用本研究建立的VP2 ELISA 方法檢測。結(jié)果顯示,2016 年~2019 年華東地區(qū)豬場SVA 抗體陽性率為70.8%,各省抗體陽性率均達(dá)67%以上。而且,2017 年~2019 年血清抗體陽性率變化趨勢基本一致(表4),表明本實(shí)驗建立的ELISA 方法可以用于臨床血清學(xué)檢測,同時表明SVA 于2016 年前已經(jīng)在我國多地感染并流行。

        表4 2016 年~2019 年5 個省份規(guī)?;i場豬血清SVA ELISA 抗體檢測結(jié)果Table 4 ELISA results of anti-SVA antibody of pig serum from large scale pig farms in 5 provinces in 2016 to 2019

        3 討 論

        SVA 基因組約為7.2 kb,包含一個開放閱讀框(ORF),編碼2 181 個氨基酸(aa)多蛋白,一個668核苷酸(nt)5'非翻譯區(qū)(UTR)和一個71-nt 3'UTR。其中編碼2 181 個氨基酸的開放閱讀框,由12 個蛋白(LPRO、VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、2C、3A、3B、3C 和3D)構(gòu)成[1-2,4]。SVA 的B 細(xì)胞表位主要存在于VP1、VP2 和VP3 蛋白。SVA 感染早期即可產(chǎn)生較強(qiáng)病毒中和抗體反應(yīng)。VP2 特異性IgM 抗體反應(yīng)與SVA 感染后的早期中和抗體水平相關(guān)。由于VP2 包含SVA 的免疫顯性T 細(xì)胞表位,VP2 誘導(dǎo)的CD4+T 細(xì)胞數(shù)量和CD4+T、CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)均高于VP1[14-15]。Dvorak 等在進(jìn)行大量血清樣品檢測后,發(fā)現(xiàn)單獨(dú)包被VP2 抗原ELISA 板的敏感性和特異性均高于VP1 和VP3[13]。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)并制備獲得反應(yīng)性較好的VP2 重組蛋白,建立了VP2 蛋白間接ELISA 抗體檢測方法。該方法與CSFV、PRRSV和PCV2抗體均無交叉反應(yīng)性,敏感性達(dá)91.6%,與中和抗體試驗符合率達(dá)91.9%。

        血清學(xué)回顧性研究有助于全面了解地區(qū)病毒的感染情況,如Saporiti 等利用中和試驗對2007 年~2016年巴西不同豬場進(jìn)行了血清學(xué)回顧性研究,發(fā)現(xiàn)2014 年前巴西主要豬場不存在SVA 感染,2014 年~2016 年 間SVA 抗 體 陽 性 率 為36.4%[16]。2015 年 以來,我國廣東、湖北、河南和遼寧等多省份已確診多例SVA 感染豬群[9-10]。本研究采用該方法對2016年~2019 年華東地區(qū)江蘇、山東、浙江、安徽和山西5 個省市規(guī)?;i場臨床血清進(jìn)行了回顧性血清抗體檢測,結(jié)果顯示,2016 年~2019 年各省份SVA抗體陽性率達(dá)70.8%以上,證明我國多個省份規(guī)?;i場均已存在SVA 感染,與范慧等報道的結(jié)果基本一致[12]。目前我國該病尚未列入官方動物疫病監(jiān)控計劃,也缺少商品化ELISA 抗體檢測試劑盒和免疫防控方法。本研究為我國塞內(nèi)卡病的診斷和防控提供參考。

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