龔偉 黃淵 程楓 趙歡 陳國榮

隨著高清B超檢查應(yīng)用的普及，甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷率越來越高。超聲引導(dǎo)下的細(xì)針穿刺活檢是甲狀腺結(jié)節(jié)診斷中的重要一環(huán)。雖然該法準(zhǔn)確性高、可重復(fù)進(jìn)行且費(fèi)用低廉，臨床上已廣泛應(yīng)用[1]，但甲狀腺結(jié)節(jié)的確診仍然受到許多因素（比如結(jié)節(jié)的大小、性質(zhì)、位置、獲得的細(xì)胞學(xué)材料的數(shù)量以及涂片的質(zhì)量等）的影響，有15%～30%診斷不能明確，這對臨床醫(yī)生作出是否手術(shù)的決定是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)[2]。甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺最常見的惡性腫瘤，BRAFV600E突變是其特異性生物標(biāo)志，在組織學(xué)檢測上具有極高的陽性預(yù)測值（95.5%～100.0%）[3]，中國的甲狀腺乳頭狀癌中BRAFV600E突變率為72.4%[4]，因此采用細(xì)胞學(xué)材料來檢測BRAFV600E突變則具有十分重要的意義。本文旨在探討當(dāng)常規(guī)穿刺細(xì)胞學(xué)難以定性診斷甲狀腺結(jié)節(jié)時(shí)，采用相應(yīng)的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本檢測BRAFV600E突變狀態(tài)的應(yīng)用價(jià)值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年3月到2019年3月在麗水市中心醫(yī)院同時(shí)進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)穿刺和甲狀腺切除手術(shù)的患者795例，細(xì)胞學(xué)診斷根據(jù)甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda報(bào)告系統(tǒng)（TBS診斷報(bào)告系統(tǒng)）分類：1類為標(biāo)本無法診斷或標(biāo)本不滿意，2類為良性，3類為意義不明確的細(xì)胞非典型病變或意義不明確的濾泡性病變，4類為濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤，5類為可疑惡性腫瘤，6類為惡性腫瘤。本研究共納入經(jīng)甲狀腺TBS診斷為3、4、5類的患者135例作為研究對象，其中男27例，女 108 例，年齡 28～81（53.6±12.8）歲。本研究經(jīng)麗水市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 方法 B超下定位，用無負(fù)壓25G針以約3次/s的頻率針吸甲狀腺結(jié)節(jié)，每個(gè)可疑結(jié)節(jié)針吸3次，涂片后迅速固定于95%乙醇溶液中，用于HE染色，多余材料打入新柏液基保存瓶作薄層細(xì)胞病理學(xué)檢查。將細(xì)胞學(xué)材料用干凈的刀片刮下，對BRAFV600E的變異進(jìn)行檢測。為了明確在不能明確診斷細(xì)胞學(xué)（TBS 3、4、5類）中分子測試的臨床意義，將細(xì)胞學(xué)中出現(xiàn)BRAF突變且術(shù)后證實(shí)為甲狀腺乳頭狀癌者定義為真陽性；無BRAFV600E突變，術(shù)后也沒有組織學(xué)惡性證據(jù)者定義為真陰性；有BRAFV600E突變，但術(shù)后證實(shí)為良性者定義為假陽性；細(xì)胞學(xué)材料中無BRAFV600E突變，但是組織學(xué)證實(shí)為惡性者則定義為假陰性。分別計(jì)算靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值以及準(zhǔn)確率。其中3、4類惡性風(fēng)險(xiǎn)低于5類，且3、4類的處理與5類的不同，前者多為觀察或診斷性切除，后者則多手術(shù)切除。因此將3、4類的62例患者歸為組1，5類的73例患者為組2。在135例患者中75例為組織學(xué)證實(shí)的惡性腫瘤，其中70例為甲狀腺乳頭狀癌，5例為濾泡癌。在這70例乳頭狀癌中，BRAF突變56例，3類2例，5類54例，分別分析BRAFV600E突變與B超各項(xiàng)特征的關(guān)系。

1.3 BRAFV600E的突變檢測 采用熒光PCR（ARMS）法。首先將看過的細(xì)胞學(xué)涂片放置二甲苯浸泡5 min，脫去樹脂及蓋玻片，再分別經(jīng)過二甲苯5 min，2道無水乙醇（各3 min），自然晾干后，將細(xì)胞學(xué)材料用干凈的刀片刮下，進(jìn)行消化過程，提取DNA。準(zhǔn)備好試劑盒中的反應(yīng)混合液和陽性質(zhì)控品，上樣DNA，離心或者輕甩8聯(lián)PCR反應(yīng)管，使得所加試劑聚集到反應(yīng)管底部，并將反應(yīng)管置入實(shí)時(shí)PCR儀器，進(jìn)行3個(gè)階段的擴(kuò)增程序，在第3階段60℃收集信號，執(zhí)行實(shí)時(shí)PCR。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

組1和組2的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本BRAFV600E突變診斷的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和診斷準(zhǔn)確率見表1。組1和組2的真陽性個(gè)數(shù)、真陰性個(gè)數(shù)、假陽性個(gè)數(shù)和假陰性個(gè)數(shù)見表2、3。B超特征BRAFV600E突變的關(guān)系分析見表4，其中BRAFV600E突變與結(jié)節(jié)回聲質(zhì)地、結(jié)節(jié)的大小均有關(guān)（均P＜0.05），與其余指標(biāo)則均無關(guān)（均P＞0.05）。組1、組2與BRAFV600E突變的關(guān)系見表5。細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中BRAF野生型和突變型分別見圖1、2。

表1 組1和組2的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本BRAFV600E突變診斷甲狀腺癌的參數(shù)（%）

表2 組1 BRAFV600E突變的四格表參數(shù)（例）

表3 組2 BRAFV600E突變的四格表參數(shù)（例）

3 討論

進(jìn)入分子病理時(shí)代后，分子檢測已成為腫瘤診斷、治療和患者預(yù)后的重要輔助手段。目前已知BRAF基因是人類最重要的原癌基因之一。BRAFV600E的突變可導(dǎo)致RAF/絲裂原活化蛋白激酶信號通路的持續(xù)激活，從而引起腫瘤細(xì)胞的分化增殖、代謝和生長的改變，是甲狀腺乳頭狀癌最常見的基因變異，而超聲診斷惡性占所有甲狀腺結(jié)節(jié)的7%～15%，其中甲狀腺乳頭狀癌就占了85%～90%[5]。在臨床實(shí)踐中，單純靠B超分流甲狀腺結(jié)節(jié)患者已經(jīng)無法滿足臨床醫(yī)生的要求，因此在B超定位下的細(xì)針穿刺已成為評價(jià)甲狀腺結(jié)節(jié)的重要手段。但是由于不可抗拒的因素，細(xì)胞學(xué)的3、4、5類的診斷是無法避免的，且3、4類的診斷惡性風(fēng)險(xiǎn)低，其中3類的惡性風(fēng)險(xiǎn)為6%～18%，5類的惡性風(fēng)險(xiǎn)為45%～60%[6]。

表4 70例乳頭狀癌患者一般資料及BRAF突變與B超影像學(xué)的關(guān)系[例（%）]

表5 組1和組2 BRAFV600E突變的關(guān)系（例）

本研究中，組1中檢測BRAFV600E的靈敏度并不高，但是組1和組2具有100.0%的特異度和陽性預(yù)測值，這與相關(guān)文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)是符合的，因此在細(xì)胞學(xué)材料中加做BRAFV600E可以有效地幫助確診乳頭狀癌，避免患者的手術(shù)延誤[7]。在BRAF陰性的情況下，結(jié)合B超、PET-CT等檢查手段則可以極大地減少不必要的手術(shù)。比較組1和組2中BRAFV600E突變的檢測率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步說明了5類細(xì)胞學(xué)診斷發(fā)生惡性風(fēng)險(xiǎn)高于3類診斷。

甲狀腺癌中BRAFV600E的突變流行率取決于以下幾個(gè)因素：地理環(huán)境、種族和碘的攝入，其中亞洲人群BRAFV600E的突變率最高（84.5%），西方人群最低（30%～50%）[8]。BRAFV600E的突變與甲狀腺乳頭狀癌的亞型相關(guān)，80%～100%的高柱狀亞型乳頭狀癌（罕見）、45%～68%的經(jīng)典型乳頭狀癌（常見）和高達(dá)12%～18%的濾泡亞型乳頭狀癌中出現(xiàn)BRAFV600E突變[9]。而在中國，大多數(shù)的甲狀腺癌為經(jīng)典型乳頭狀癌，因此大多數(shù)的情況下，穿刺細(xì)胞學(xué)難以定性診斷的患者多涉及到甲狀腺乳頭狀癌與良性病變的鑒別診斷。細(xì)胞學(xué)標(biāo)本上進(jìn)行BRAFV300E檢測的診斷價(jià)值隨地理環(huán)境和種族的不同而產(chǎn)生變化。在西方，該診斷的靈敏度下降到40%，盡管理論上特異度和陽性預(yù)測值仍然不變。而在亞洲人群中，甲狀腺乳頭狀癌BRAFV300E突變率高，這使在細(xì)胞學(xué)標(biāo)本上進(jìn)行BRAFV300E的檢測具有更加重要的意義。

圖1 細(xì)胞學(xué)標(biāo)本BRAFV600E野生型

圖2 細(xì)胞學(xué)標(biāo)本BRAFV600E突變型

本研究在B超特征與BRAFV600E突變的關(guān)系中，結(jié)果顯示除了回聲質(zhì)地和結(jié)節(jié)大小外，其他參數(shù)與BRAFV600E的關(guān)系不大。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，認(rèn)為BRAFV600E的突變與B超特征無關(guān)[10-11]，但是也有文獻(xiàn)指出BRAFV600E的突變與常見的可疑B超特征是相關(guān)的，它包括縱橫比失調(diào)、邊界不清、低回聲、微鈣化和空暈的缺失,當(dāng)≥3個(gè)可疑B超特征同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，BRAFV600E的陽性預(yù)測值可達(dá)82%[12]。不管怎樣，由于本研究樣本量偏小，且只局限于分析不能明確診斷的結(jié)節(jié)中BRAFV600E突變，故B超特征與BRAFV600E的關(guān)系需要更進(jìn)一步的廣泛研究來證實(shí)。

綜上所述，對于常規(guī)穿刺細(xì)胞學(xué)難以明確性質(zhì)的甲狀腺結(jié)節(jié)，采用細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的BRAFV600E檢測對于外科醫(yī)生作出相應(yīng)的臨床處理具有重要的意義，可減少延誤手術(shù)的機(jī)會，可在具有分子病理實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)院推廣使用。