胡霄 朱明輝 蒲青凡 周瑞耀

原發(fā)性肝癌（90%以上是肝細(xì)胞性肝癌）是全球范圍內(nèi)的常見惡性腫瘤，具有高病死率和高發(fā)病率的特點(diǎn)，而中國(guó)的肝癌發(fā)病數(shù)占全球肝癌總發(fā)病數(shù)的50%[1]。目前，手術(shù)切除是肝癌最主要的治療方式，放化療對(duì)肝癌的治療效果比較有限。顯然，研究和開發(fā)新型的抗肝癌藥物以提高中晚期肝癌患者的治療效果和延長(zhǎng)其生存期具有重要的臨床意義。組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase,HDAC）具有催化組蛋白去乙?；?，維持染色體中組蛋白乙?；?去乙酰化平衡的功能。組蛋白乙?；c基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期進(jìn)展、基因沉默、DNA復(fù)制、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞分化等現(xiàn)象有關(guān)[2]。Quisinostat是新型氧肟酸鹽類HDAC抑制劑，其主要抑制靶點(diǎn)為I類和Ⅱ類HDAC家族蛋白[3]。體外研究證實(shí)Quisinostat在肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多個(gè)腫瘤細(xì)胞株中有明顯的抑癌效果[3]，但對(duì)其具體抗腫瘤機(jī)制尚未完全闡明。目前國(guó)內(nèi)鮮見報(bào)道Quisinostat對(duì)肝癌抑制作用的研究。因此，本研究通過(guò)觀察HDAC抑制劑Quisinostat對(duì)肝癌細(xì)胞株Huh7細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以評(píng)價(jià)Quisinostat的抗肝癌效果，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 肝癌細(xì)胞株 Huh7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)凍存。

1.1.2 藥品HDAC抑制劑Quisinostat（規(guī)格：5 mg/支）購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；Caspase抑制劑Z-VAD-FMK（規(guī)格：1 mg/支）購(gòu)自美國(guó)Selleck公司。上述藥物均用二甲基亞砜（DMSO）溶解、分裝，-20℃避光保存。實(shí)驗(yàn)前用MEM培養(yǎng)液稀釋成工作濃度?？刂艱MSO終濃度≤0.1%。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑RIPA細(xì)胞裂解液、BeyoECL Plus（P0018）試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒均購(gòu)自南京碧云天生物技術(shù)公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；凋亡試劑盒（Annexin-V FITC/PI）購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein,BAX）、剪切型半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶-9（Cleaved Caspase-9）、剪切型半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）等兔單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；β-肌動(dòng)蛋白（β-Actin）、p53蛋白、細(xì)胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）、p21 和 p27 等兔單克隆抗體以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔第二抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.1.4 主要儀器 IX71倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；高速冷凍離心機(jī)（micro21R型）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；蛋白凝膠電泳系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司（ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)）；DYNEX MUM型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)DYNEX Technologies公司；BD LSRII數(shù)字化分析型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度Quisinostat處理組細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 采用CCK-8法。取處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7細(xì)胞，接種細(xì)胞密度為3×104/ml。將細(xì)胞種于96孔板，細(xì)胞數(shù)為3 000個(gè)/孔。細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的Quisinostat，使其終濃度分別 12.5、25、50、100、200 nM，對(duì)照組則加等量不含Quisinostat的培養(yǎng)液。每種濃度5個(gè)平行孔。分別于24、48、72 h取1塊96孔培養(yǎng)板測(cè)定吸光度（OD值）以計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。計(jì)算公式：細(xì)胞增殖抑制率＝1－OD（藥物）/OD（對(duì)照）。

1.2.2 不同濃度Quisinostat處理組細(xì)胞周期占比檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)。取處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7細(xì)胞，接種于6孔板中，Huh7細(xì)胞種板數(shù)為15×104個(gè)。細(xì)胞貼壁后加入0、25、50 nM Quisinostat處理48 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。48 h后消化收集0、25、50 nM處理的肝癌細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。應(yīng)用含有0.2 mg RNase A的1 ml PI/Triton X-100 染色液（20 μg PI/0.1% Triton X-100）37℃染色15 min。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，用Modfit LT軟件分析流式周期結(jié)果，統(tǒng)計(jì)不同濃度組G0/G1期、S期、G2/M期、S期+G2/M期所占百分比。

1.2.3 不同濃度Quisinostat處理組細(xì)胞凋亡率檢測(cè)采用Annexin-V FITC/PI雙染法。取處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7細(xì)胞接種于6孔板中。Huh7細(xì)胞種板數(shù)為15×104個(gè)。細(xì)胞貼壁后加入 0、25、50、100 nM Quisinostat處理48 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，采用Annexin-V FITC/PI凋亡試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 單用Quisinostat和聯(lián)合Z-VAD-FMK處理Huh7細(xì)胞的凋亡率檢測(cè) 采用Annexin-V FITC/PI雙染法檢測(cè)。取處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7細(xì)胞接種于6孔板。細(xì)胞貼壁后加藥。實(shí)驗(yàn)分組：0 nM Quisinostat組、50 nM Quisinostat組、50 nM Quisinostat＋50 μm Z-VAD-FMK組（作為實(shí)驗(yàn)組）。藥物處理48 h后，收集細(xì)胞，用Annexin-V FITC/PI凋亡試劑盒對(duì)細(xì)胞染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 不同濃度Quisinostat處理組細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 采用Western blot法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6 cm平皿，待細(xì)胞貼壁后加入0、25、50、100 nM Quisinostat。48 h 后提取總蛋白，用 BCA法測(cè)定蛋白濃度。等量加樣，蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)膜后，封閉液室溫封閉2 h。用1∶1 000稀釋的目的蛋白一抗于4℃孵育過(guò)夜。洗膜后用1∶2 000稀釋的二抗孵育2 h。用BeyoECL Plus（P0018）試劑使目的蛋白發(fā)光。用Bio-rad ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，分析測(cè)定各條帶面積灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。以β-Actin為內(nèi)參，用上述方法分析目的蛋白（BAX、Bcl-2、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、p53、Cyclin D1、p21 和p27蛋白）的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.01統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示。多組間比較采用單因素方差分析或雙因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Quisinostat處理組Huh7細(xì)胞增殖抑制率比較 隨著Quisinostat濃度增加，Huh7細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加（P＜0.05）；同一濃度Quisinostat下Huh7細(xì)胞增殖抑制率隨著時(shí)間延長(zhǎng)也逐漸增強(qiáng)（P＜0.05）。見圖1。

2.2 不同濃度Quisinostat處理組Huh7細(xì)胞各細(xì)胞周期占比的比較 與0 nM組相比，25、50 nM組G0/G1期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞明顯減少，S期+G2/M期細(xì)胞明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而3組比較G2/M期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 不同濃度Quisinostat處理組Huh7細(xì)胞增殖抑制率比較

2.3 不同濃度Quisinostat處理組Huh7細(xì)胞凋亡率比較 3組間Huh7細(xì)胞晚期、早期凋亡率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），且與 0 nM 比較，25、50、100 nM組Huh7細(xì)胞晚期、早期凋亡率均更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

表1 不同濃度Quisinostat處理組Huh7細(xì)胞各細(xì)胞周期占比的比較

2.4 單用Quisinostat與聯(lián)合Z-VAD-FMK處理Huh7細(xì)胞的凋亡率比較 3組間Huh7細(xì)胞晚期、早期凋亡率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；且與0 nM Q組比較，50 nM Q 組、50 nM Q+50 μm Z 組 Huh7細(xì)胞晚期、早期凋亡率均更高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與 50 nM Q 組比較，50 nM Q+50 μm Z 組 Huh7細(xì)胞晚期、早期凋亡率均更低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表 3。

表2 不同濃度Quisinostat作用下肝癌Huh7細(xì)胞凋亡率比較

2.5 不同濃度Quisinostat組Huh7細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 Western blot結(jié)果顯示，隨著Quisinostat濃度升高，BAX、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、p53、p21、p27 蛋白表達(dá)水平均逐漸增高，Bcl-2、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平均逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）。見圖 2、3，表 4、5。

表3 單用Quisinostat與聯(lián)合Z-VAD-FMK處理Huh7細(xì)胞的凋亡率比較

圖2 不同濃度Quisinostat組Huh7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖（Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白；BAX為Bcl-2相關(guān)X蛋白；Cleaved Caspase-3為剪切型半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶-3；Cleaved Caspase-9為剪切型半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶-9）

3 討論

圖3 不同濃度Quisinostat組Huh7細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖（Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1）

Quisinostat是一種新型的HDAC抑制劑。一項(xiàng)基于嚙齒類動(dòng)物模型的研究證實(shí)Quisinostat能有效的抑制多發(fā)骨髓瘤，明顯減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腫瘤負(fù)荷，并減少腫瘤血管新生[4]。有臨床Ⅰ期研究用Quisinostat+硼替佐米+地塞米松的聯(lián)合方案治療復(fù)發(fā)的多發(fā)性骨髓瘤患者，其中約88.2%的患者可取得較好的治療效果[5]。此外，有臨床Ⅰ期研究用Quisinostat治療實(shí)體瘤患者，該研究總共納入了92例患者，其中9.8%的患者病情經(jīng)治療后能得到有效控制[6]。另有臨床Ⅱ期研究評(píng)價(jià)了Quisinostat治療復(fù)發(fā)或難治性皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的療效，結(jié)果顯示總皮膚反應(yīng)率為24%，其中1例患者經(jīng)Quisinostat治療150 d，皮膚腫瘤完全緩解，5例患者的皮膚腫瘤部分緩解[7]。本研究表明Quisinostat能有效將肝癌Huh7細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖，并且誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。

細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化由周期蛋白依賴激酶（CDK）和其對(duì)應(yīng)的活化亞單位周期蛋白所控制。Cyclin D1是G1/S期更換的重要周期蛋白。Cyclin D1表達(dá)下降，則細(xì)胞阻滯于G1期[8]。p21和p27則是與G1/S期轉(zhuǎn)換相關(guān)的上游調(diào)控蛋白，起抑制周期蛋白/CDK復(fù)合物功能的作用[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的Quisinostat作用后，Huh7細(xì)胞的周期蛋白Cyclin D1表達(dá)下降，而p21和p27蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。因此，筆者認(rèn)為Quisinostat可通過(guò)誘導(dǎo)p21和p27蛋白的表達(dá)，抑制Cyclin D1蛋白，達(dá)到周期阻滯。

為明確Quisinostat誘導(dǎo)凋亡機(jī)制，筆者檢測(cè)了凋亡效應(yīng)蛋白的改變。在不同濃度的Quisinostat的作用下，隨著凋亡程度的提高，活化形式的Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3表達(dá)水平也明顯增加，這些數(shù)據(jù)從分子水平證實(shí)Quisinostat激活了Cleaved Caspase-9為代表的線粒體途徑。Caspase抑制劑Z-VAD-FMK抑制了Quisinostat的促凋亡作用，進(jìn)一步證實(shí)了Quisinostat促凋亡作用對(duì)Caspase途徑的依賴性。線粒體異常是激活Caspase效應(yīng)蛋白的上游機(jī)制之一。Bcl-2家族蛋白的失衡、Bcl-2家族成員形成的線粒體跨膜通道是導(dǎo)致線粒體膜通透性改變及線粒體途徑凋亡的重要原因[10]。本研究結(jié)果證實(shí)在Quisinostat處理肝癌細(xì)胞后，Bcl-2/BAX比率明顯下降。p53蛋白是線粒體途徑凋亡上游重要調(diào)控因子，筆者發(fā)現(xiàn)Quisinostat處理肝癌細(xì)胞后，p53蛋白表達(dá)明顯增加。p53過(guò)度表達(dá)能抑制Bcl-2，且活化BAX，導(dǎo)致凋亡。因此，筆者認(rèn)為p53信號(hào)通路激活，線粒體凋亡相關(guān)蛋白失衡，是Quisinostat誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。

表4 不同濃度Quisinostat組Huh7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

表5 不同濃度Quisinostat組Huh7細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

綜上所述，Quisinostat在體外能有效抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，它有潛力成為治療肝癌的藥物。但目前還有較多未知問(wèn)題需要進(jìn)一步研究。首先，Quisinostat對(duì)其他信號(hào)分子的作用需深入明確；其次，Quisinostat對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移和血管新生的作用需進(jìn)一步闡明。相信對(duì)Quisinostat的深入研究，將為肝癌治療提供新的藥物選擇。