錢紅月，肖移生，侯吉華，姜?jiǎng)铝?/p>

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330004)

機(jī)體進(jìn)入老齡，記憶力會(huì)有不同程度的衰減，嚴(yán)重者可出現(xiàn)癡呆，記憶認(rèn)識(shí)障礙是危害老年人健康的重要因素[1]。當(dāng)前，人口老齡化已成為全球性社會(huì)問題，研發(fā)抗衰老、抗癡呆藥物用于改善老年人記憶、認(rèn)知功能已成為國際醫(yī)藥界研究的熱點(diǎn)[2]。黃精地龍配伍為筆者團(tuán)隊(duì)中藥配伍復(fù)方的重要成果之一，該配伍可改善造模性癡呆大、小鼠學(xué)習(xí)記憶功能，增加腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，減少丙二醛(MDA)含量，顯示出良好的抗氧化、抗炎、降低神經(jīng)中樞氧化應(yīng)激水平的作用[3]，并可調(diào)控中樞神經(jīng)膽堿能遞質(zhì)系統(tǒng)發(fā)揮抗癡呆作用[4-6]，且該配伍對(duì)體外培養(yǎng)分化的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞Aβ25-35損傷具有良好的保護(hù)作用，促進(jìn)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞增殖，這與其具有抗氧化損傷、調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等機(jī)制有關(guān)[7-8]。這些研究顯示出黃精地龍配伍具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用。由此，可以推測該配伍也具有改善自然老齡動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的功能。本課題擬觀察黃精地龍配伍對(duì)自然老齡小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬神經(jīng)凋亡的影響，驗(yàn)證該配伍神經(jīng)保護(hù)作用的可重復(fù)性及穩(wěn)定性，并為其臨床轉(zhuǎn)化提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

40只SPF級(jí)、雄性、18月齡昆明小鼠(自然老齡小鼠，體質(zhì)量(38±4)g)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，再隨機(jī)分成老齡組、黃精地龍低、中、高劑量組(分別為2、4、8 g·kg-1·d-1劑量[3])，每組10只老齡小鼠；另有10只SPF級(jí)、雄性、2月齡昆明小鼠(體質(zhì)量(22±2)g)設(shè)為青年對(duì)照組。所有動(dòng)物由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證編號(hào)：SYXK(贛)2017-0004)。本課題動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(批準(zhǔn)編號(hào)：20191025186)，研究中動(dòng)物處置全過程嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)條例。

1.2 試驗(yàn)藥物與試劑

黃精地龍配伍由酒黃精、炙地龍兩味中藥按質(zhì)量1∶1組成，兩味中藥均購自江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診中藥房，經(jīng)鑒定屬合格品，符合國家中藥臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)；焦油紫為Solarbio公司產(chǎn)品；Bcl-2及Caspase-3兔抗小鼠一抗均為美國Invitrogen公司的產(chǎn)品；免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。

1.3 儀器

EX-TE-03小型中藥提取罐(上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)，STRIKE 300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國ChemTron公司)，DT-200型小鼠跳臺(tái)儀(上?？禐獒t(yī)療公司)，BW100型曠場實(shí)驗(yàn)箱(荷蘭Noldus公司)，BX-41型顯微數(shù)碼系統(tǒng)(日本Olympus公司)，Motic Image Advanced3.2圖像數(shù)據(jù)分析軟件(德國Motic公司)。

2 方法

2.1 試驗(yàn)藥液提取制備

按本課題組成熟的方法提取黃精地龍配伍藥液[3-7]，即稱取黃精、地龍各200 g，混合后粉碎，加10倍量的蒸餾水充分浸泡，加熱后沸水回流1 h，濾過，收集藥液；向藥渣內(nèi)再加3倍量蒸餾水，并再次沸水回流30 min，濾過，收集藥液；合并兩次提取藥液后進(jìn)行離心；取上清藥液再濃縮成200 mL藥液(每1 mL相當(dāng)于含生藥1 g)。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)

黃精地龍低、中、高劑量組各小鼠分別灌胃2、4、8 g·kg-1·d-1黃精地龍濃縮提取液，老齡組各小鼠灌胃0.5 mL·d-1生理鹽水。以上各組小鼠連續(xù)灌胃干預(yù)4周，4周后進(jìn)行各指標(biāo)檢測。青年對(duì)照組小鼠無特殊干預(yù)，僅日常飼養(yǎng)。

2.3 跳臺(tái)試驗(yàn)

參考本課題組常用的跳臺(tái)試驗(yàn)方法進(jìn)行[3-4]。即實(shí)驗(yàn)分訓(xùn)練和測驗(yàn)兩部分進(jìn)行，訓(xùn)練時(shí)先將小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)3 min，然后立即通以36 V交流電，動(dòng)物受到電擊后跳上平臺(tái)以躲避電擊為正確反應(yīng)，如再次跳到銅柵上受到電擊，即為錯(cuò)誤反應(yīng)。如此訓(xùn)練5 min，由系統(tǒng)自動(dòng)記錄每只小鼠受電擊后跳上平臺(tái)的反應(yīng)時(shí)間及跳下平臺(tái)受電擊的錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)，作為學(xué)習(xí)成績。24 h后再做測驗(yàn)，測驗(yàn)時(shí)將小鼠平穩(wěn)放在跳臺(tái)上，記錄第一次跳下平臺(tái)的潛伏期和5 min內(nèi)錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)，作為動(dòng)物的記憶保持能力。若5 min內(nèi)小鼠未跳下平臺(tái)，潛伏期按300 s計(jì)算。

2.4 曠場試驗(yàn)

曠場實(shí)驗(yàn)箱為一長、寬、高為55 cm×55 cm×30 cm的裝置，正上方2 m處有紅外攝像頭，視野可覆蓋整個(gè)曠場，底面被平均分成25個(gè)小格，中間9個(gè)小格為中央?yún)^(qū)，其余16個(gè)小格則為周圍區(qū)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將小鼠置于曠場的正中央，讓其自由探索10 min，由系統(tǒng)自動(dòng)記錄并進(jìn)行分析，計(jì)算小鼠在中央?yún)^(qū)的活動(dòng)時(shí)間以及10 min內(nèi)的活動(dòng)總路程，重復(fù)檢測3次。本實(shí)驗(yàn)需在安靜、回避人的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，且每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，均需用酒精擦拭曠場，以消除氣味對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

2.5 取材

完成曠場實(shí)驗(yàn)后次日，深度麻醉小鼠后由心臟左心室內(nèi)灌注4%多聚甲醛固定，再取出大腦置于4%多聚甲醛再固定48 h(4 ℃)，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，行冠狀位連續(xù)切片，用于海馬尼氏染色及免疫組化染色。

2.6 尼氏染色

海馬切片晾干后置于0.1%的焦油紫溶液中37 ℃染色5 min，蒸餾水沖洗；95%酒精分化，蒸餾水沖洗；梯度酒精(70%→80%→90%→95%I→95% II→100% I→100%II)各3 min脫水，二甲苯I、二甲苯II透明各3 min，中性樹膠封片；光鏡下觀察各組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)、數(shù)量等的變化。神經(jīng)元計(jì)數(shù)方法：于10×40倍光鏡下，每一腦片隨機(jī)選取相鄰3個(gè)視野，鏡下面積為4.5×10-2mm2，運(yùn)用 Motic 數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)數(shù)神經(jīng)元，結(jié)果取平均值。

2.7 免疫組化染色

免疫組化染色步驟按試劑盒推薦的SP法操作，使用的一抗有Bcl-2及Caspase-3抗體(1∶500)。同尼氏染色的神經(jīng)元觀察與計(jì)數(shù)方法，光鏡下觀察各組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)免疫陽性神經(jīng)元并計(jì)數(shù)。

2.8 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的學(xué)習(xí)和記憶成績比較

與青年對(duì)照組比較，老齡組小鼠學(xué)習(xí)反應(yīng)時(shí)間明顯延長，記憶潛伏時(shí)間明顯縮短，學(xué)習(xí)與記憶成績的錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多(P<0.01)；與老齡組比較，黃精地龍低、中、高劑量組小鼠學(xué)習(xí)反應(yīng)時(shí)間縮短，記憶潛伏時(shí)間延長，學(xué)習(xí)與記憶成績的錯(cuò)誤次數(shù)減少(P<0.05，P<0.01)，且隨藥物劑量增加，效果越明顯(量效關(guān)系明顯)。見表1。

表1 各組小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的學(xué)習(xí)和記憶成績比較

3.2 各組小鼠曠場試驗(yàn)的中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間和活動(dòng)總路程的比較

與青年對(duì)照組比較，老齡組小鼠中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間及活動(dòng)總路程均明顯縮短(P<0.01)；與老齡組比較，黃精地龍低、中、高劑量組小鼠的中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間及活動(dòng)總路程均明顯變長(P<0.05，P<0.01)，且量效關(guān)系明顯。見表2。

表2 各組小鼠曠場試驗(yàn)的中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間和活動(dòng)總路程的比較

3.3 各組小鼠海馬尼氏染色CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量比較

與青年對(duì)照組比較，老齡組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量均明顯減少(P<0.01)；與老齡組比較，黃精地龍低、中、高劑量組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量均明顯增多(P<0.05，P<0.01)，且量效關(guān)系明顯。見表3。

表3 各組小鼠海馬尼氏染色CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量比較

3.4 各組小鼠海馬CA1及CA3區(qū)的Bcl-2、Caspase-3陽性神經(jīng)元數(shù)量比較

與青年對(duì)照組比較，老齡組小鼠海馬CA1與CA3區(qū)的Bcl-2免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯降低、Caspase-3免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯升高(P<0.01)；與老齡組比較，黃精地龍低、中、高劑量組小鼠海馬CA1與CA3區(qū)的Bcl-2免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯升高、Caspase-3免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且量效關(guān)系明顯。見表4。

表4 各組小鼠海馬CA1及CA3區(qū)的Bcl-2、Caspase-3陽性神經(jīng)元數(shù)量比較

4 討論

衰老是生命后期階段進(jìn)行的全身性、多方面、復(fù)雜的退化過程，涉及全身多功能系統(tǒng)，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的衰老更明顯，會(huì)出現(xiàn)日益嚴(yán)重的記憶認(rèn)知功能障礙[9]。在腦組織的衰老過程中，總是伴隨著一定量的神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少，從而引發(fā)腦部功能逐漸減退。機(jī)體的大腦海馬區(qū)是管理學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知功能的重要結(jié)構(gòu)。大量的基礎(chǔ)研究和臨床研究表明，大腦海馬區(qū)是衰老、癡呆病變的主要部位之一，如海馬萎縮、神經(jīng)元變性、丟失等[10-11]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大腦海馬區(qū)受損傷可引起動(dòng)物記憶、認(rèn)知功能障礙，且嚴(yán)重程度與損傷度成正比[12]。臨床也發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)腫瘤患者接受射線照射治療時(shí)，海馬輻射劑量越大，患者的記憶、認(rèn)知障礙越嚴(yán)重[13]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，老年癡呆大鼠的海馬病變明顯，結(jié)構(gòu)萎縮模糊，神經(jīng)元數(shù)量明顯減少[5-6]。因此，在防治衰老、癡呆的課題中，對(duì)海馬神經(jīng)保護(hù)研究的意義重大。本課題發(fā)現(xiàn)，衰老小鼠的學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知功能明顯減退，這與其大腦海馬各區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少有關(guān)。黃精地龍配伍可保護(hù)海馬神經(jīng)，能明顯升高衰老小鼠海馬各區(qū)神經(jīng)元數(shù)量，進(jìn)而改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知功能，且呈現(xiàn)明顯的藥效關(guān)系。這與本課題組前期有關(guān)黃精地龍配伍抗大、小鼠老年癡呆的研究結(jié)果類似[3-6]。這些研究表明，黃精地龍配伍具有較好的防治老年癡呆、抗衰老的作用，其神經(jīng)保護(hù)作用較明顯，且其有效性、重復(fù)性、穩(wěn)定性均佳，具備臨床應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

機(jī)體一旦衰老，往往會(huì)出現(xiàn)一定程度的焦慮精神狀態(tài)，并伴隨著自發(fā)活動(dòng)能力與探索行為能力的衰減[14-15]。曠場實(shí)驗(yàn)箱是檢測動(dòng)物焦慮程度、自發(fā)活動(dòng)與探索行為能力的有效設(shè)施，小鼠在曠場中央?yún)^(qū)的活動(dòng)時(shí)間反映其焦慮程度，中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間越長，焦慮程度則越低。小鼠的活動(dòng)總路程長短可反映其自發(fā)活動(dòng)能力與探索行為能力的強(qiáng)弱。本課題顯示，黃精地龍配伍可降低衰老小鼠的焦慮程度，提高其自發(fā)活動(dòng)能力與探索行為能力。這表明，該配伍可緩解老年個(gè)體的精神焦慮狀態(tài)，調(diào)節(jié)其神經(jīng)心理功能。

Bcl-2為關(guān)鍵的凋亡抑制基因，在維持細(xì)胞存活中發(fā)揮著重要作用，而Caspase-3則為重要的凋亡執(zhí)行基因，細(xì)胞內(nèi)此二者的表達(dá)活性狀態(tài)對(duì)細(xì)胞的抗凋亡與凋亡影響至關(guān)重要[16]。本課題還發(fā)現(xiàn)，衰老小鼠海馬各區(qū)Bcl-2表達(dá)明顯下降，Caspase-3表達(dá)明顯上升，這表明海馬神經(jīng)元凋亡是導(dǎo)致衰老小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量減少的重要因素。黃精地龍配伍能有效升高衰老小鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)、降低Caspase-3表達(dá)，發(fā)揮重要的抗海馬神經(jīng)元凋亡作用。由此可知，黃精地龍配伍抗癡呆、抗衰老的作用與其通過抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用有關(guān)。

中醫(yī)對(duì)人體衰老或早衰的認(rèn)識(shí)源遠(yuǎn)流長，中醫(yī)理論認(rèn)為衰老是由機(jī)體陰陽失調(diào)、精氣虧耗、臟腑虛衰、血瘀絡(luò)滯所致，其中，當(dāng)以“腎虛致衰”為根本。腎元之陽氣和腎藏之精氣虧損、虛少，則五臟之氣血津液生化乏源，五臟氣血津液生化無源則導(dǎo)致諸多衰老病態(tài)和衰老過程[17-18]。因此，針對(duì)衰老病機(jī)，中醫(yī)采取補(bǔ)腎填精、益氣健脾、活血通絡(luò)、化痰開竅等治法抗衰老。黃精地龍配伍系本課題組依據(jù)中醫(yī)理論的自創(chuàng)方，組方精煉，方中黃精具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾益腎等功效，常作食療[19]。地龍具有平肝祛風(fēng)、通經(jīng)活絡(luò)等功效，民間也可作食療之用[20]，兩者結(jié)合，既遵守中藥組方原則，又符合中醫(yī)藥食同源學(xué)說，可針對(duì)衰老、癡呆病機(jī)進(jìn)行辨證論治。本課題組實(shí)驗(yàn)已證實(shí)黃精地龍配伍抗衰老、抗癡呆的有效性和可重復(fù)性，在中醫(yī)臨床運(yùn)用中也發(fā)現(xiàn)該配伍有效，但具體療效尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。