蔣 暢，闞永軍，趙 立，肖 慶，韓 靜*，胡 娟

(1.福建省中醫(yī)藥科學院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003)

由新型冠狀病毒(2019-nCoV)引起的肺炎疫情(COVID-19)自2019年末暴發(fā)，肆虐至今，截至目前全球已有上百萬人被感染[1]。新冠肺炎是繼SARS、MERS后，由冠狀病毒引發(fā)的又一新型大范圍流行病，對公共安全造成了極大威脅。新冠肺炎患者前期出現(xiàn)乏力、干咳、胃腸道不適等癥狀，后期病情加劇，可出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征并引發(fā)膿毒性休克，嚴重危及患者生命[2-4]。尋找到針對新型冠狀病毒的特效藥物，抑制新冠肺炎的全球蔓延趨勢，是當前科研工作的重中之重。

在應(yīng)對病原體尚未明確的新型突發(fā)性傳染病時，傳統(tǒng)中醫(yī)可在辨證論治的理論體系指導(dǎo)下進行有效診療，具有獨特優(yōu)勢[5]。中醫(yī)學將此類病毒導(dǎo)致的傳染性疾病歸于“溫病”范疇，在數(shù)千年的歷史實踐中積累了大量治療此類疾病的相關(guān)經(jīng)驗，《金匱要略》《黃帝內(nèi)經(jīng)》等中醫(yī)經(jīng)典中亦收錄了大量相關(guān)處方[6-8]。在當前緊迫的抗疫局勢下，從療效確切的中醫(yī)藥相關(guān)處方中尋找有效防治新冠肺炎的藥物刻不容緩。

國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中明確指出，新冠肺炎病在寒濕[9]。根據(jù)“風能勝濕”理論，常用藥對荊芥-防風廣泛應(yīng)用于中醫(yī)溫病經(jīng)方[10]，《本草求真》云：“用防風必兼荊芥者，以其能入肌膚宣散故耳?！薄妒┙衲珜λ幣R床經(jīng)驗集》云：“若屬外感證，用麻桂嫌熱、嫌猛；用銀翹嫌寒時，荊防用之最宜?！鼻G芥味辛，性溫，入肺、肝經(jīng)；防風味辛、甘，性微溫，入膀胱、肝、脾經(jīng)[11]，二者合用十分切合新冠肺炎的中醫(yī)病機，可能對防治新冠肺炎具有積極作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學分析注重系統(tǒng)性、綜合性、整體協(xié)調(diào)性，與中草藥多成分靶標、多途徑協(xié)同作用的特點具有相似性[12]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法篩選荊芥-防風藥對防治新冠肺炎可能的作用靶標，并通過分子對接進行藥物-靶標結(jié)合位點分析，探討其防治新型冠狀病毒肺炎的可能作用機制，為尋找新冠肺炎防治藥物提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 活性成分與相關(guān)靶標的收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP(http：//tcmspw.com/index.php)對荊芥(SchizonepetaeHerba)、防風(SaposhnikoviaeRadix)的化學成分進行檢索，根據(jù)藥物動力學參數(shù)ADME，以生物利用率OB≥30%及類藥性DL≥0.18為標準進行進一步篩選，獲得荊芥-防風藥對的活性成分及其對應(yīng)的靶標信息。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)獲取各靶標蛋白所對應(yīng)的人類基因名，對靶標蛋白進一步標準化，建立數(shù)據(jù)集。

1.2 新冠肺炎靶標的收集

利用GenCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)，以“COVID-19”為關(guān)鍵詞，限定物種為“Homo Sapiens”，檢索并收集與新冠肺炎相關(guān)的基因靶標。

1.3 荊芥-防風藥對防治新冠肺炎的作用靶標預(yù)測

通過Venny(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將藥物預(yù)測靶標與新冠肺炎靶標進行映射，獲得荊芥-防風藥對防治新冠肺炎的潛在作用靶標并進行可視化分析。

1.4 基因富集分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)對“1.3”項中所收集的共同靶標進行GO(Gene Ontology)富集分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路富集分析，通過OmicShare(https：//www.omicshare.com/tools/)對結(jié)果進行可視化處理。

1.5 成分-靶標-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過Cytoscape軟件，將“1.1”項中所收集的藥物活性成分、“1.3”項中所收集的共同靶標及“1.4”項中所得到的作用通路構(gòu)建為“成分-靶標-通路”網(wǎng)絡(luò)并進行可視化，通過網(wǎng)絡(luò)分析獲得核心靶標及關(guān)鍵核心成分。

1.6 成分-靶標分子對接

通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找荊芥-防風藥對關(guān)鍵活性成分與部分現(xiàn)階段臨床報道有效藥物的2D結(jié)構(gòu)，通過Chem 3D軟件優(yōu)化力學結(jié)構(gòu)后保存，作為配體；通過PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/)查找SARS-CoV-2 3CL水解酶(PDB id：6M2Q)及ACE2(PDB id：1R42)的蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)，通過PyMol軟件刪除水分子及蛋白結(jié)構(gòu)中的小分子配體后，加氫保存，作為受體；利用CB-Dock(http：//cao.labshare.cn/cb-dock/)進行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物與相關(guān)靶標篩選結(jié)果

中藥多為口服給藥，其體內(nèi)過程包括吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)、排泄(Excretion)，藥物的ADME屬性對預(yù)測藥物的生物活性及利用率有著重要意義。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，以口服生物利用率OB≥30%，類藥性DL≥0.18為篩選條件，篩查得到荊芥與防風的活性化合物分別為11個、18個，其中活性成分MOL000358、MOL000359為二者共有，刪除重復(fù)項后共獲得荊芥-防風藥對活性化合物27個，涉及212個靶標(見表1、表2)。

續(xù)表1

表2 荊芥-防風藥對活性化合物作用靶標

2.2 荊芥-防風藥對防治新冠肺炎的潛在作用靶標

將212個荊芥-防風藥對作用靶標與從GenCards數(shù)據(jù)庫中收集的350個新冠肺炎作用靶標進行映射，取交集共得到47個交叉靶標，即荊芥-防風藥對防治新冠肺炎的潛在作用靶標，見圖1。

圖1 荊芥-防風藥對與新冠肺炎靶標Venn圖

2.3 GO富集分析結(jié)果

將47個荊芥-防風藥對防治新冠肺炎的潛在作用靶標導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，從生物學過程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF)和細胞組分(Cellular component，CC)三個部分進行富集分析，可知荊芥-防風藥對參與了細胞因子介導(dǎo)的信號通路、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡以及蛋白受體結(jié)合等相關(guān)生物學過程，結(jié)果見表3、表4、表5。

表3 GO富集分析(BP)Top30

表4 GO富集分析(CC)Top20

表5 GO富集分析(MF)Top30

2.4 KEGG富集分析結(jié)果

通過STRING數(shù)據(jù)庫對47個荊芥-防風藥對防治新冠肺炎的潛在作用靶標進行KEGG信號通路富集分析，以FDR值與基因相關(guān)數(shù)進行排序，取前20條為顯著相關(guān)通路，涉及IL、NF-κB信號通路以及甲型流感、皰疹病毒感染、結(jié)核等多條感染相關(guān)通路，結(jié)果見圖2。

圖2 KEGG富集結(jié)果(Top20)

2.5 成分-靶標-通路網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape軟件處理“1.1”項中所收集的藥物活性成分、“1.3”項中所收集的共同靶標及“1.4”項中所得到的作用通路，構(gòu)建為“成分-靶標-通路”網(wǎng)絡(luò)并進行可視化處理，結(jié)果見圖3。該網(wǎng)絡(luò)共有90個節(jié)點，430條邊。藍色矩形各點代表荊芥-防風藥對中的有效化合物，黃色圓圈與紅色圓圈中各個點分別代表不同的作用靶標和通路。網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析結(jié)果表示，該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的平均度值為9.56，大于平均度值的節(jié)點共43個，平均中介中心度為18.02，大于平均中介中心度的節(jié)點有33個，以網(wǎng)絡(luò)拓撲學核心特征節(jié)點度值、中介中心度均大于平均值為條件進行篩選顯示，槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、β-谷固醇等有效化合物及IL-6、TP53、CASP3、IL10、MAPK1、CXCL8、CCL2、IL1B、MAPK14、RELA、PTGS2、IL4、FOS等作用靶標在荊芥-防風藥對的化合物-作用靶標-通路網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，涉及多條病毒性感染、免疫調(diào)控、炎癥通路，這可能是荊芥-防風藥對發(fā)揮新冠肺炎防治效果的核心化合物、作用靶標以及通路。

圖3 成分-靶標-通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對接結(jié)果分析

將荊芥-防風藥對中排序前4位的核心活性化合物及部分現(xiàn)階段臨床報道有效的藥物(氯喹、瑞德西韋、利托那韋、洛匹那韋)通過CB-Dock與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2進行分子對接，預(yù)測藥物與蛋白靶標之間的相互作用模式。結(jié)果顯示，荊芥-防風藥對中的核心活性化合物與ACE2及2019-nCoV水解酶對接Vina得分均小于-6，且最優(yōu)結(jié)合位點大多與現(xiàn)階段臨床報道有效藥物結(jié)合位點一致，提示核心活性化合物與蛋白靶標之間發(fā)生相互作用的可能性較大(見表6)，核心活性化合物與蛋白靶標結(jié)合示意圖見圖4、圖5。

表6 藥物-靶標分子對接匯總

圖4 荊芥-防風藥對核心化合物與ACE2分子對接

圖5 荊芥-防風藥對核心化合物與2019-nCoV3CL水解酶分子對接

3 討論

新冠肺炎屬于中醫(yī)學“溫病”范疇，以寒濕邪毒為主要病因病機，患者前期主訴食少便溏而非發(fā)熱。荊芥-防風為臨床常用辛溫解表藥對，荊芥祛風解表、宣毒透疹、理血止痙；防風祛風解表、疏肝解痙、殺蟲止癢。現(xiàn)代藥理學研究證實二者均可解熱鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、增強免疫功能，具有相似的藥理作用[13-15]。可見，新冠肺炎的發(fā)病特點、臨床癥狀、中醫(yī)證候與荊芥-防風藥對的臨床應(yīng)用相符，該藥對具有防治新冠肺炎的可能性。

在本研究中，藥物成分-基因靶標-疾病網(wǎng)絡(luò)共有90個節(jié)點、430個連接，在一定程度上反映了藥物與靶標之間相互作用的復(fù)雜性。通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，荊芥-防風藥對防治新冠肺炎的可能生物過程涉及細胞反應(yīng)、信號傳導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)、細胞凋亡等；細胞組成涉及膜筏、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、受體因子復(fù)合體等；分子功能涉及蛋白受體結(jié)合、激酶活化、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，荊芥-防風藥對涉及皰疹病毒感染、利什曼病、查加斯病、乙型肝炎、結(jié)核、百日咳、甲型流感等多條病毒感染通路，其防治新冠肺炎的可能機制與TNF信號通路、NF-κB信號通路介導(dǎo)細胞炎性因子IL-17有較為緊密的聯(lián)系。

2019-nCoV與SARS-CoV的感染途徑相同，均通過病毒表面S蛋白與宿主細胞ACE2結(jié)合入侵[16]。藥物作用于ACE2特異性位點可阻斷病毒S蛋白與之結(jié)合，達到防治目的。2019-nCoV 3CL水解酶負責水解多聚蛋白，使之具有復(fù)制及轉(zhuǎn)錄功能，是新冠病毒復(fù)制過程中的重要一環(huán)[17]。分子對接結(jié)果顯示荊芥-防風藥對核心活性化合物對ACE2和2019-nCoV 3CL水解酶均具有較好的結(jié)合性，且最優(yōu)結(jié)合位點大多與現(xiàn)階段臨床報道的有效藥物的結(jié)合位點一致。該結(jié)果進一步證明了荊芥-防風藥對作用于新冠肺炎關(guān)鍵靶標蛋白的可能性以及網(wǎng)絡(luò)藥理學分析預(yù)測的可靠性。

綜上所述，荊芥-防風藥對可能通過多種活性化合物調(diào)控細胞因子，參與炎性反應(yīng)及免疫應(yīng)答過程，介導(dǎo)多條炎癥、感染相關(guān)信號通路，發(fā)揮防治新冠肺炎的作用。這一獨特的作用機制體現(xiàn)出了中藥治療疾病多成分靶標、多途徑協(xié)同作用的特點。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法結(jié)合分子對接技術(shù)對荊芥-防風藥對防治新型冠狀病毒肺炎的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制進行了初步探究，為后續(xù)相關(guān)制劑開發(fā)研究奠定了基礎(chǔ)。

目前大多數(shù)分子對接工具都需要在用戶預(yù)先設(shè)定對接位置坐標的基礎(chǔ)上進行擬合[18]，本次研究所采用的CB-Dock可通過perl腳本自動計算空腔中心并應(yīng)用于AutoDock Vina計算[19]，結(jié)果更為精準可信。但需要注意的是，受限于目前計算機擬合方法本身的局限性，分子對接計算結(jié)果可能與實際臨床療效不盡相同，只有立足于臨床藥效觀察情況，開展相關(guān)實驗研究對計算結(jié)果進行驗證，方能去偽存真，為中藥防治新冠肺炎提供更加充分有力的證據(jù)。