孫紅勇，林法喜*

（南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取2018年1月～2020年1月江蘇省人民醫(yī)院男性不育癥患者50例，年齡27～49歲，平均（33.5±5.4）歲。在精子癥類型方面，弱精子癥14例（28.0%），少精子癥36例（72.0%）。將這些患者作為不育癥組，另回顧性選取同期我院正常生育男性50例作為正常生育組，年齡26～48歲，平均（32.3±5.2）歲。兩組男性的一般資料比較差異均不顯著，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 納入與排除標準

納入標準：（1）性生活均正常；（2）夫婦婚后均同居1年以上。排除標準：（1）女方不孕因素；（2）避孕。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑與設備

購買北京航天瑞麒科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的敬業(yè)分析儀，美國BD公司生產(chǎn)的FITC-Annexin V/PI熒光染色試劑（貨號：556547）。

1.3.2 精子凋亡檢測

在離心管中放置標本，將PBS液加入其中，洗滌2次，進行10 min離心，將速率設定為3000 r/min，將上清液去除，在-80℃冰箱中凍存精子備用。在冰水中放置精子標本復溫，用冷PBS液對精子懸液進行稀釋，在試管中加入約5×106個精子，將PBS液加入，洗滌，進行10 min的離心，將速率設定為3000 r/min，將上清液棄去。用1ml Annexin V Binding Buffer重懸浮，在試管中加入100 μL。將5 μL FITCAnnexin、10 μL PI加入染色，室溫下進行15 min避光靜置后將400 μL孵育緩沖液加入，終濃度約為1×106精子/mL。1 h內采用流式細胞儀，應用精子動（靜）態(tài)圖像分析系統(tǒng)分析精子密度、活力，將凋亡率（PAS）計算出來，計算方法為凋亡精子數(shù)與精子總數(shù)的百分率。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0，計量資料用（±s）表示，用t檢驗；應用雙變量直線相關分析，將Pearson相關系數(shù)計算出來。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 兩組男性的精液密度、A級、A+B級精子、凋亡率比較

不育癥組弱精子癥患者的精液密度顯著高于少精子癥患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），凋亡率顯著低于少精子癥患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但弱精子癥和少精子癥患者的A級精子、A+B級精子之間的差異均不顯著，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。少精子癥患者的精子密度顯著低于正常生育組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），凋亡率顯著高于正常生育組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但弱精子癥患者和正常生育組男性的精液密度、凋亡率之間的差異均不顯著，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；弱精子癥、少精子癥患者的A級、A+B級精子均顯著低于正常生育組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組男性的精液密度、A級、A+B級精子、凋亡率比較（±s）

表1 兩組男性的精液密度、A級、A+B級精子、凋亡率比較（±s）

組別 精子癥類型 密度（×106/mL） A級精子（%） A+B級精子（%） 凋亡率（%）不育癥組（n=50） 弱精子癥 84.0±13.5 12.8±2.0 25.5±4.9 8.8±1.4少精子癥 11.2±2.7 12.8±2.0 23.3±4.7 25.8±4.3正常生育組（n=50） 78.0±14.1 33.3±5.4 49.7±7.5 11.3±2.5

2.2 不育癥組患者的精液密度、A級、A+B級精子與凋亡率的相關性分析

不育癥組患者的精液密度與凋亡率呈顯著的負相關關系，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但A級、A+B級精子與凋亡率之間無相關性，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不育癥組患者的精液密度、A級、A+B級精子與凋亡率的相關性分析

3 討 論

細胞凋亡指多細胞有機體由基因控制的細胞主動死亡過程，目的為對機體發(fā)育進行調控，對穩(wěn)定的內環(huán)境進行維護。在精子發(fā)生過程中，精子凋亡是一個重要特征，在對正常精子數(shù)量進行維持的過程中，自發(fā)凋亡發(fā)揮著極為重要的作用。而誘發(fā)過多的生精細胞凋亡這一病理現(xiàn)象是異常的，會直接引發(fā)男性不育癥。本研究結果表明，不育癥組弱精子癥患者的精液密度顯著高于少精子癥患者，凋亡率顯著低于少精子癥患者。少精子癥患者的精子密度顯著低于正常生育組，凋亡率顯著高于正常生育組；弱精子癥、少精子癥患者的A級、A+B級精子均顯著低于正常生育組。不育癥組患者的精液密度與凋亡率呈顯著的負相關關系，說明少精子癥發(fā)生的一個原因可能為精子過量凋亡。

20世紀70年代，流式細胞術發(fā)展起來，其能夠以較快的速度定量分析單細胞，目前已經(jīng)在各個領域廣泛應用。胞漿、核染色質在細胞凋亡的情況下濃縮，核裂解，促進凋亡小體的產(chǎn)生，相應改變細胞的光散射性質，而在對光散射進行測定的過程中，流式細胞術是極為簡單的細胞凋亡檢測方法，其一方面能夠定性，另一方面還能夠定量，具有較快的檢測速度、較大的數(shù)據(jù)采集量、較為客觀、全面的分析等，這就將一種較為理想的手段提供給了臨床對不同原因引發(fā)精子凋亡進行深入研究的工作，同時，在對精子功能、男性生育力進行評估的過程中，流式細胞術也可以作為一種新方法，應用前景極為廣闊。

綜上所述，男性不育癥與流式細胞術檢測精子凋亡關系密切，值得臨床充分重視。