傅雯 柏樺 王瑤 李恩霜 錢玉霞 楊嬌 鄒偉

摘 要：目的：利用秀麗隱桿線蟲(chóng)為模式生物，研究維生素C在秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)的抗氧化效應(yīng)及其機(jī)制。方法：分別以含有0.05、0.25、0.5 mg/mL維生素C的NGM培養(yǎng)基飼養(yǎng)秀麗隱桿線蟲(chóng)，測(cè)定不同濃度維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的含量，同時(shí)檢測(cè)0.25 mg/mL的維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)age-1、daf-2、daf-16、sir-2.1、clt-1基因mRNA變化。在高氧環(huán)境中，干擾0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)daf-2、daf-16基因表達(dá)檢測(cè)線蟲(chóng)的存活情況，觀察0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)DAF-16入核情況。結(jié)果：0.25 mg/mL的維生素C提高秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)SOD和CAT活力，在高氧環(huán)境中，0.25 mg/mL的維生素C降低age-1、daf-2基因表達(dá)，提高daf-16基因表達(dá)，同時(shí)增加DAF-16蛋白入核。結(jié)論：維生素C通過(guò)DAF-16胰島素信號(hào)通路增強(qiáng)秀麗隱桿線蟲(chóng)抗氧化作用。

關(guān)鍵詞：秀麗隱桿線蟲(chóng);抗氧化作用;維生素C;胰島素信號(hào)途徑

及時(shí)消除機(jī)體內(nèi)的自由基將會(huì)減少人類很多衰老疾病，如糖尿病、老年癡呆癥等。維生素C有兩種異構(gòu)體，分別是L型和D型，其中L型抗壞血酸是一種良好的水溶性抗氧化劑，廣泛存在于新鮮的蔬菜、水果中，人體自身不能合成需通過(guò)進(jìn)食獲取[1-3]。維生素C能維持人體紅細(xì)胞ATP酶以及超氧化物歧化酶（SOD）活性，在起到降低血漿丙二醛和鉀離子含量的作用的同時(shí)，也可以清除體內(nèi)多種有害自由基，包括超氧負(fù)離子、羥自由基、有機(jī)自由基、有機(jī)過(guò)氧基等，從而保護(hù)機(jī)體免受自由基的破壞[4-5]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，不同的維生素C濃度對(duì)抗氧化作用的調(diào)節(jié)不同，高濃度的條件下維生素C具有促氧化作用，在細(xì)胞外液中產(chǎn)生過(guò)氧化氫（H2O2）后進(jìn)入細(xì)胞，加速產(chǎn)生更多的活性氧（ROS）損傷DNA，造成細(xì)胞膜功能障礙[6]。適當(dāng)濃度維生素C對(duì)衰老大鼠紅細(xì)胞的抗氧化能力具有修復(fù)作用[7]，不同質(zhì)量濃度的維生素C可以降低亞硝酸鹽對(duì)匙吻鱘仔魚(yú)脅迫作用[8]，在一定濃度范圍內(nèi)維生素C可促進(jìn)維生素D3活化，從而在降低體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平時(shí)可以同步提高機(jī)體的抗氧化能力[9]。維生素C在秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)調(diào)節(jié)抗氧化的分子機(jī)制尚不完善，基于對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)機(jī)制的探索操作易行，且其與人類的遺傳物質(zhì)相似，可用于代謝功能研究[10]。因此，以秀麗隱桿線蟲(chóng)為模式生物，測(cè)定其體內(nèi)的抗氧化酶活力、相關(guān)基因（age-1、daf-2、daf-16、sir-2.1、clt-1等）的表達(dá)水平。其次，在高氧環(huán)境中，通過(guò)基因干擾的方法探討維生素C在秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化過(guò)程中起的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

維生素C，上海生工生物工程有限公司;SOD試劑盒、CAT試劑盒，南京建成生物工程研究所;RNA提取試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司;c-DNA合成試劑盒、SYBR Green，天根生化科技（北京）有限公司;q-PCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成;daf-16（ot971[daf-16：GFP]）秀麗隱桿線蟲(chóng)株（以下簡(jiǎn)稱daf-16：GFP秀麗隱桿線蟲(chóng)株），用綠色熒光蛋白將DAF-16蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，由云南大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 儀器與設(shè)備

倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司;超聲破碎儀，寧波新芝生物科技公司;酶標(biāo)儀，鄭州安圖實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;低溫高速離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司;PCR儀器，德國(guó)Biometra公司;電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 秀麗隱桿線蟲(chóng)培養(yǎng) 接種線蟲(chóng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基（NGM）中，待線蟲(chóng)大量產(chǎn)卵后進(jìn)行同步化得到蟲(chóng)卵。4 000 r/min離心30 s后收集蟲(chóng)體和蟲(chóng)卵于15 mL離心管中，去上清液，加入次氯酸鈉200 μL和5 mol/L氫氧化鈉50 μL，邊震蕩邊觀察直至蟲(chóng)體破碎，立即加入M9至管中14 mL刻度處，4 000 r/min離心2 min，去上清液。加入M9至管中14 mL刻度處，4 000 r/min離心2 min沖洗4次。留1 mL液體混勻后加入到培養(yǎng)皿中，補(bǔ)充適量的M9。放置于20攝氏度的恒溫箱培養(yǎng)12 h，待蟲(chóng)卵孵化，將其加入到新鮮NGM培養(yǎng)基中長(zhǎng)至未產(chǎn)卵的成蟲(chóng)階段備用。

1.3.2 抗氧化酶活力測(cè)定 將同步化后L1期線蟲(chóng)分別加入含有0、0.05、0.25、0.5 mg/mL維生素C的NGM平板中培養(yǎng)2 d后，收集至EP管。M9洗滌并加入200 μL生理鹽水于超聲破碎儀上破碎，取上清液，按照超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒的操作步驟測(cè)定SOD、CAT活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 線蟲(chóng)同步化后收集蟲(chóng)卵孵化L1線蟲(chóng)，將L1線蟲(chóng)加至普通NGM平板或維生素C的NGM平板中進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后收集線蟲(chóng)。按照寶生物工程（大連）有限公司的RNA提取試劑盒的步驟提取線蟲(chóng)的總RNA，按照天根生化科技有限公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成c-DNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。我們以gpd-1為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt計(jì)算0.25 mg/mL維生素C處理組較之對(duì)照組age-1、daf-2、daf-16、sir2.1、clt-1基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，引物序列見(jiàn)表1。

1.3.4 線蟲(chóng)RNAi干擾 接種HT115菌株、age-1以及daf-16基因干擾株于5 mL含100 μg/mL的氨芐培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，取300 μL菌液加至含1 mmol/L IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和100 μg/mL AMP的NGM培養(yǎng)基上并吹干，20 ℃恒溫箱培養(yǎng)12 h，誘導(dǎo)小RNA的生成。將L1線蟲(chóng)加入成功誘導(dǎo)出小RNA生成的平板中，培養(yǎng)48 h，收集平板上的線蟲(chóng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 線蟲(chóng)急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 將野生型線蟲(chóng)、0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)、0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)age-1RNAi線蟲(chóng)和0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)daf-16 RNAi線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到含1‰ H2O2及對(duì)應(yīng)濃度維生素C平板（加入產(chǎn)卵抑制劑FUDR）中，每組3板，每板30條線蟲(chóng)左右。每間隔2 d觀察線蟲(chóng)存活情況，直至所有平板有線蟲(chóng)死亡為止，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 線蟲(chóng)熒光觀察 將daf-16：GFP L4期線蟲(chóng)和0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)daf-16：GFP L4期線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到含1‰ H2O2和對(duì)應(yīng)濃度維生素C平板（加入產(chǎn)卵抑制劑FUDR）1 d后，熒光顯微鏡下觀察DAF-16入核情況（n=20），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 采用GraphPad軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行率的比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度維生素C對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)SOD和CAT活力的影響

將L1線蟲(chóng)飼養(yǎng)于含0、0.05、0.25、0.5 mg/mL的維生素C NGM平板2 d后，收集未產(chǎn)卵的成蟲(chóng)，分別測(cè)定SOD和CAT活力，與對(duì)照組相比，0.05 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)SOD活力無(wú)明顯增強(qiáng)（P>0.05），將濃度提高至0.25 mg/mL后，SOD活力增強(qiáng)為261.7%（P<0.05），濃度提升至0.5 mg/mL，SOD活力增強(qiáng)為116%（P<0.05）。此外與對(duì)照組相比，0.05 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)CAT活力無(wú)明顯提升（P>0.05），0.25 mg/mL處理后，CAT活力提升為155.8%（P<0.05），濃度提升至0.5 mg/mL，SOD活力無(wú)明顯增強(qiáng)（P>0.05）。表2表明，0.25 mg/mL的維生素C濃度提升秀麗隱桿線蟲(chóng)SOD和CAT活力。

2.2 高氧環(huán)境中維生素C提升線蟲(chóng)存活率

在NGM平板中加入1‰過(guò)氧化氫（H2O2）后，形成高氧環(huán)境。與對(duì)照組0 mg/mL相比，高氧環(huán)境中線蟲(chóng)壽命縮短。此外，在高氧環(huán)境中，0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)壽命得到部分回復(fù)（圖1），0.25 mg/mL的維生素C具有保護(hù)線蟲(chóng)應(yīng)對(duì)高氧環(huán)境的作用。

2.3 維生素C對(duì)線蟲(chóng)抗氧化基因表達(dá)水平的影響

檢測(cè)0 mg/mL（對(duì)照組）維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)和0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)age-1、ctl-1、sir-2.1、daf-2、daf-16基因的mRNA水平。與對(duì)照組相比，0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)daf-16 mRNA水平增加（P<0.05），daf-2、age-1mRNA水平下降（P<0.05），ctl-1、sir-2.1 mRNA水平無(wú)明顯變化（P>0.05）（表3）。

2.4 高氧環(huán)境中維生素C通過(guò)DAF-16胰島素信號(hào)途提升線蟲(chóng)存活率

將0 mg/mL（對(duì)照組）線蟲(chóng)、0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)、0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)age-1RNAi線蟲(chóng)和0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)daf-16 RNAi線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到含1‰ H2O2及對(duì)應(yīng)濃度維生素C平板（加入產(chǎn)卵抑制劑FUDR）中，每組3板，每板30條線蟲(chóng)左右。每間隔2 d觀察線蟲(chóng)存活情況，直至所有平板所有線蟲(chóng)死亡為止，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。與0 mg/mL（對(duì)照組）相比，0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)壽命增加（P<0.05），0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)daf-16 RNAi線蟲(chóng)壽命無(wú)明顯變化（P>0.05），0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)age-1RNAi線蟲(chóng)壽命增加（P<0.05）（圖2）。age-1表達(dá)量降低增強(qiáng)daf-16的活性，從而增強(qiáng)線蟲(chóng)抗逆境的能力，而daf-16的活性降低線蟲(chóng)存活率無(wú)明顯變化，表明age-1、daf-16信號(hào)通路在維生素C調(diào)控線蟲(chóng)抗氧化中的關(guān)鍵作用。

2.5 H2O2高氧應(yīng)激情況下維生素C增加DAF-16入核

比較在H2O2高氧條件下，0 mg/mL（對(duì)照組）線蟲(chóng)、0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)DAF-16蛋白入核情況，0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)高于0 mg/mL（對(duì)照組）線蟲(chóng)（P<0.05）（圖3）。H2O2高氧情況下，維生素C促使線蟲(chóng)DAF-16蛋白入核來(lái)增強(qiáng)線蟲(chóng)抵抗高氧環(huán)境。

3 討論

線蟲(chóng)體內(nèi)存在SOD、CAT分別負(fù)責(zé)清除線蟲(chóng)體內(nèi)過(guò)量的超氧化物自由基和H2O2，抗氧化酶活力的升高標(biāo)志著線蟲(chóng)抗氧化能力的增強(qiáng)。daf-16是FOXO（叉頭轉(zhuǎn)錄因子）家族的同源物，受到age-1和daf-2活性的抑制，在線蟲(chóng)的壽命、免疫及應(yīng)激等方面發(fā)揮正調(diào)控作用[11]，其中，daf-2是人胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子受體家族的同族體[12]、age-1是哺乳動(dòng)物磷脂酰激酶-3-羥基激酶的同族體[13]。研究表明，age-1基因突變后，個(gè)體表現(xiàn)出壽命延長(zhǎng)的表型，同時(shí)在氧化應(yīng)激條件下，daf-2突變體也表現(xiàn)出比野生型更強(qiáng)的抵抗能力[14]。線蟲(chóng)體內(nèi)daf-2受體與胰島素配體結(jié)合后可以引發(fā)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶age-1[13]，而age-1又可通過(guò)AKT-1/AKT-2/SGK-1通路引起叉頭轉(zhuǎn)錄因子daf-16磷酸化[14-15]。daf-16的活性大小調(diào)節(jié)該信號(hào)通路對(duì)機(jī)體壽命影響，因此daf-16被認(rèn)為是機(jī)體壽命、熱刺激以及抵抗氧化應(yīng)激的重要監(jiān)控器，可激活為靶基因如sod-3和ctl-1[16-19]等。研究發(fā)現(xiàn)，0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲(chóng)后，SOD和CAT水平增加，體內(nèi)的daf-2、age-1的表達(dá)量均下降，同時(shí)daf-16表達(dá)量上調(diào)并大量進(jìn)入細(xì)胞核從而增強(qiáng)線蟲(chóng)抗逆境的能力，這說(shuō)明維生素C可以通過(guò)參與daf-16胰島素信號(hào)通路的調(diào)控來(lái)增強(qiáng)線蟲(chóng)的抗氧化能力。◇

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Vitamin C Enhances Antioxidant Activity Through Insulin Signaling Pathway in Caenorhabditis elegans

FU Wen，BAI Hua，WANG Yao，LI En-shuang，QIAN Yu-xia，YANG Jiao，ZOU Wei

（School of Public Health，Kunming Medical University，Kunming 650500，China）

Abstract：Objective To investigate the antioxidation effect and mechanism of vitamin C in model organism Caenorhabditis elegans.Method Caenorhabditis elegans was cultured in Nematode Growth Medium containing vitamin C of different mass concentrations（0.05，0.25，0.5 mg/mL）.The contents of superoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT）was detected，then the mRNA changes of age-1，daf-2，daf-16，sir-1，clt-1 genes was detected by qPCR.Meanwhile，we verified the survival rate after interference the daf-2 or daf-16 gene expression and observed the situation of DAF-16 enter the nucleus in the H2O2 oxidative stress environment treated by 0.25 mg/mL of vitamin C.Result The result showed that 0.25 mg/mL of vitamin C increased the activity of superoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT）.In the H2O2 oxidative stress environment，0.25 mg/mL of vitamin C up-regulated the expression level of daf-16 gene，down-regulated the expression level of age-1 and daf-2 gene，and increased DAF-16 entering the nucleus.Conclusion Vitamin C enhances the antioxidant activity through DAF-16 insulin signaling pathway in Caenorhabditis elegans.

Keywords：Caenorhabditis elegans;antioxidative effect;vitamin C;insulin signaling pathway

基金項(xiàng)目：云南省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（昆醫(yī)聯(lián)合專項(xiàng)）（項(xiàng)目編號(hào)：2018FE001-309）;云南省教育廳科學(xué)研究基金（項(xiàng)目編號(hào)：2017ZDX159）。

作者簡(jiǎn)介：傅 雯（1998— ），女，學(xué)士，研究方向：生物分析與檢測(cè)。

通信作者：鄒 偉（1988— ），男，博士，講師，研究方向：生物分析與檢測(cè)。