張美蘭，沈哲式，張英哲，金雪梅，韓龍哲，金仁順 (延邊大學附屬醫(yī)院病理科，吉林 延吉 133000)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是細胞凋亡的一條途徑，早期ERS發(fā)揮細胞保護作用，但持續(xù)的ERS使細胞凋亡信號通路被激活，以保護細胞的功能穩(wěn)定[1]。

姜黃素(curcumin)是一種從中藥姜黃(Curcuma longa L.)根莖中提取出來的脂溶性多酚類化合物，在抗腫瘤作用方面體現(xiàn)了良好的藥效。研究表明，姜黃素結合甘草次酸可以抑制人肝癌HepG-2增殖與分化，且其抗腫瘤作用機制與抑制腫瘤血管生成、抑制腫瘤細胞增殖與分化、誘導腫瘤細胞凋亡密切相關[2-3]。本實驗探究姜黃素對人肝癌BEL-7404細胞凋亡的ERS作用機制，為姜黃素的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1材料：人肝癌BEL-7404細胞購于南京凱基生物制品有限公司；姜黃素購于MCE公司；Hoechst33258染色液、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物技術有限公司；小牛血清和青鏈霉素購于美國Gibco公司；DMEM培養(yǎng)液和胰酶購于Invitorgen公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒購于索萊寶科技有限公司；PVDF膜、ECL檢測顯影液購于Merck Millipore公司；GRP78、p-elF2α、p-JNK、CHOP抗體購于CST公司；Caspase-4抗體購于Abcam公司；羊抗兔IgG購于中杉金橋生物技術有限公司；MTT粉購于美國Sigma公司。

1.2儀器：超凈工作臺(C1109C)、CO2培養(yǎng)箱(COR-1150) (上海智城分析儀制造有限公司)；電泳儀(DYY-7C)、轉(zhuǎn)膜儀(DYCZ-40D) (北京市六一儀器廠產(chǎn)品)；UPV凝膠成像儀(Biospectrum,美國UVP凝膠成像系統(tǒng)有限公司)；酶標儀(日本TECAN公司)；倒置顯微鏡 (日本Olympus公司)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)及分組：人肝癌BEL-7404細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM中，37℃、5%CO2恒溫全濕培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每48小時換液傳代，取生長良好、處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。細胞分為空白對照組(vehicle)、姜黃素組(20、40、60 μmol/L )。

2.2MTT法檢測細胞增殖：收集對數(shù)生長期的人肝癌BEL-7404細胞，制成細胞懸液，將細胞按照每孔1×104個接種于96孔板中，每孔細胞懸液200 μl。24 h 后棄去原孔內(nèi)的培養(yǎng)液，分別加入含有不同濃度姜黃素(20、40、60 μmol/L) 的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入濃度為5 g/L的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，棄其上清留底部沉淀，每孔再加入150 μl DMSO，避光放置于酶標儀內(nèi)，在波長490 nm 處測定吸光度值，計算IC50和細胞存活率。計算公式如下：

2.3Hoechst染色檢測細胞凋亡：將細胞制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×106個每孔至含有爬片的6孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入4 ml含有不同濃度姜黃素(20、40、60 μmol/L)的培養(yǎng)液培養(yǎng)。48 h后棄6孔板中培養(yǎng)液，95%乙醇固定細胞20 min，棄固定液，加入Hochest染料避光染色8 min左右，將其置于熒光顯微鏡下(400×)觀察，選取適當視野進行拍照。

2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率(Annexin V-FITC/PI 雙染)：取不同濃度姜黃素組(20、40、60 μmol/L )和DMEM對照組細胞培養(yǎng)。48 h后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，冰PBS終止消化，1 000 g離心4 min，再次清洗離心，棄上清，PBS制成細胞懸液，取各實驗組細胞約5×104個，1 000 g離心4 min，棄上清，用195 μl Annexin V-FITC結合液制得細胞重懸液，加入5 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min，再加入10 μl PI，避光孵育5 min，上機檢測，F(xiàn)ACS Diva 4.1軟件分析結果。

2.5免疫蛋白印跡檢測蛋白的表達：各實驗組細胞培養(yǎng)48 h后，提取細胞全蛋白，BCA試劑盒測定蛋白含量，配置凝膠。根據(jù)蛋白濃度計算上樣量上樣，電泳(100 V, 150 min)，轉(zhuǎn)膜(100 V, 30～80 min)。室溫下，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h。分別加入一抗(GRP78、p-elF2α、p-JNK、CHOP、Caspase-4) 室溫孵育1.5～2 h，TBST清洗PVDF膜，放入二抗室溫孵育1～1.5 h。ECL試劑盒顯影，使用G:BOX chemiXR5成像系統(tǒng)顯影，分析數(shù)據(jù)使用Image J 軟件進行灰度分析。

3 結果

3.1姜黃素對人肝癌BEL-7404細胞增殖的作用:MTT結果顯示，在不同濃度姜黃素(20、40、60 μmol/L)作用下，BEL-7404細胞的生存率明顯下降，且呈一定的濃度和時間依賴性。姜黃素作用于細胞24 h時，IC50值為40.15 μmol/L。見圖1。

與空白對照組比較，**P<0.01

3.2姜黃素對人肝癌BEL-7404細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白及凋亡蛋白表達的作用:Western blot結果顯示，隨著藥物濃度的增加，與對照組相比，姜黃素組GRP78、p-elF2α、p-JNK、CHOP、Caspase-4表達量上升。40 μmol/L、60 μmol/L姜黃素組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

與空白對照組比較，*P<0.05, **P<0.01

3.3姜黃素對人肝癌BEL-7404細胞凋亡的作用:Hoechst染色檢測發(fā)現(xiàn)，隨著姜黃素組濃度的增加，人肝癌BEL-7404細胞數(shù)量減少，藍白熒光深染，出現(xiàn)明顯細胞凋亡形態(tài)。流式細胞術結果顯示，隨著姜黃素濃度的增加，細胞凋亡率逐漸上升，20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L姜黃素組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3。

與空白對照組比較，**P<0.01

4 討論

肝細胞癌 (HCC) 是世界五大最常見惡性腫瘤之一，占我國癌癥發(fā)病率第2位和病死率的第1位[4]，嚴重威脅人類健康。姜黃素是姜黃的活性成分，具有多項生物活性，盡管其生物利用度較低，但其對肝的保護作用已在各種肝毒性方案中得到證實。已有研究表明姜黃素可改善小鼠肝損傷[5]，姜黃素半乳糖化BSA納米?？勺鳛榘邢蛩幬镙d體抑制肝癌細胞的增殖和遷移[6]，可見姜黃素具有較好的肝細胞保護作用及抗腫瘤活性。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素作用于人肝癌BEL-7404細胞后，隨著藥物濃度的增加BEL-7404細胞存活率逐漸下降，凋亡率逐漸上升，證實姜黃素對BEL-7404細胞具有生長抑制作用及促凋亡作用。

ERS是細胞發(fā)生凋亡的一條重要通路，其過程需要多種分子伴侶及特異性蛋白參與，主要包括CHOP的轉(zhuǎn)錄激活、JNK途徑、Caspase-12活化及Ca2+通路等[7]。本研究測定了姜黃素誘導BEL-7404細胞凋亡的作用機制，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，GRP78、p-elF2α、p-JNK、CHOP、Caspase-4蛋白表達量也逐漸上升，說明姜黃素誘導的BEL-7404細胞凋亡與激活ERS密切相關。

通過本研究證實，姜黃素可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激作用誘導人肝癌BEL-7404細胞發(fā)生凋亡。今后將進一步開展動物體內(nèi)實驗，深入探究其作用機制，為姜黃素的開發(fā)和利用提供可靠的實驗依據(jù)。