李 洋，趙明鏡，王保福，韓小婉，孟 慧

細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是指細胞釋放的，具有膜結構的微小囊泡的統(tǒng)稱，幾乎所有類型的細胞均可分泌[1]，在體液中廣泛存在，如血液、唾液、腦脊液、尿液、汗液、腹水、乳液和羊水中均可檢測到[2-3]。EVs攜帶來源于其母細胞的生物信息“貨物”，主要包括DNA、信使RNA(mRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)及蛋白質[1，4-5]，這些生物信息被磷脂雙分子層包裹，以防在胞外空間丟失[4]。釋放到胞外空間的EVs到達靶細胞周圍后，首先通過膜上的整合素、凝集素/蛋白聚糖、T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4(Tim4)與靶細胞識別并結合，之后靶細胞通過內吞作用、膜融合及與受體特異結合3種方式攝取EVs攜帶的“貨物”，最終靶細胞對攝取的EVs內容物進行內化，產生特定的生物學效應，實現細胞之間通訊，進而影響疾病的病理生理進程[5-6]。根據直徑大小、來源及生成方式不同將EVs分為3類：外泌體(exosomes，Exos)、微粒和凋亡小體，詳見表1。

表1 細胞外囊泡主要類型

近年來，關于EVs在疾病中作用的研究主要集中在癌癥、神經退行性疾病、糖尿病及心血管疾病等領域[4]?，F綜述EVs在心血管病中的作用，包括EVs分類、產生方式及不同來源的EVs(外泌體和微粒)在心血管疾病尤其是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)中的作用等，以期為EVs在心血管疾病發(fā)展中的病理機制、臨床應用及防治心血管疾病提供新思路。

1 外泌體

外泌體是直徑為30～200 nm的脂質雙分子層囊泡，形成過程涉及細胞內吞作用、質膜雙重內陷和多泡體形成[11-12]。在生理或病理條件刺激下，質膜第一次內陷形成內吞小泡，此時液體和細胞外成分(主要是蛋白質、脂質、代謝物、小分子和離子)通過內吞作用和質膜內陷與細胞表面蛋白一起進入細胞內，進入細胞內的多個內吞小泡融合形成早期核內體(early-sorting endosomes，ESEs)。之后ESEs內吞細胞質中的線粒體、內質網、高爾基體和核酸(DNA、mRNA、lncRNA及miRNA)，發(fā)育為晚期核內體(late-sorting endosomes，LSEs)。LSEs質膜在內吞體轉運復合體(endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT)蛋白作用下進行二次內陷形成多個大小不一的腔內小泡(inter-luminal vesicles，ILVs)，腔內小泡大小不同提示其內包含的信息不同，這使得最終形成的外泌體具有高度特異性。通過ESCRT蛋白先確定腔內小泡大小之后選擇適合的貨物，還是先由ESCRT蛋白選擇好特定的貨物之后由貨物含量決定腔內小泡大小尚無統(tǒng)一定論[13]。因含腔內小泡的LSEs外觀形似多囊泡，因此稱為多泡體(multivesicular bodies，MVBs)。相關研究發(fā)現，多泡體主要有兩種結局：一是與自噬體和溶酶體融合從而被降解，降解產物被細胞回收；二是借助細胞骨架及微管網絡運輸到質膜，通過多泡體對接蛋白?？吭谫|膜腔側，再通過胞吐方式將腔內小泡釋放到胞外空間，這些被釋放到胞外空間的腔內小泡稱為外泌體[5，12，14]，至于多泡體如何選擇兩種結局機制目前尚不明確。由于雙重內陷過程，外泌體中膜拓撲結構與細胞質膜拓撲結構一致[4，15]。

參與外泌體生成的蛋白主要有ESCRT蛋白、調節(jié)真核細胞內小泡運輸的Rab蛋白、細胞骨架蛋白、凋亡相關基因2-相互作用蛋白X(ALIX)、四跨膜蛋白(CD9、CD63和CD81)、熱休克蛋白(HSP)、黏附分子、溶酶體相關膜蛋白1(LAMP1)和腫瘤易感基因101(TSG101)、多泡體對接蛋白、磷脂、神經酰胺、鞘磷脂酶和可溶性馬來酰胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE)[4，12]。外泌體普遍存在的標志物包括ALIX、四跨膜蛋白(CD9、CD63和CD81)、LAMP1、TSG101及SNARE[12]。

除普遍存在的標志物外，重要的是外泌體攜帶不同母細胞的生物信息及在不同病理狀態(tài)下發(fā)揮的作用。根據Exo Carta的外泌體數據庫(http://www.exocarta.org)記載，對286個不同類型的細胞和生物體來源的外泌體研究發(fā)現了9 769種蛋白質、3 408種mRNA、2 838種miRNA和1 116種脂蛋白。

心血管領域目前主要集中于外泌體miRNA作用方面的研究。已了解到的來源于內皮細胞、血小板、干細胞、心肌細胞、免疫細胞及脂肪細胞釋放的外泌體，現按照不同來源的外泌體在心血管疾病中作用進行介紹[14，16]。

1.1 內皮細胞來源外泌體 根據產生的條件及包含的miRNA不同，內皮細胞來源的外泌體(endothelial cell-derived exosomes，EC-Exos)對心血管系統(tǒng)不但具有抗損傷的保護作用[17-19]，也能促進斑塊形成，加重心血管負擔。

有研究發(fā)現，在缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)條件下，將心肌細胞與人臍靜脈內皮細胞來源外泌體(human umbilical vein endothelial cell derived exosomes，HUVEC-Exos)共同培養(yǎng)后，HUVEC-Exos可激活心肌細胞絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調節(jié)蛋白激酶(MAPK/ERK1/2)信號通路，增加心肌細胞對缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷的抵抗能力，明顯降低心肌細胞死亡率[17]。一項研究表明，長期運動或層流剪切力增加能上調含miR-342-5p的EC-Exos表達，miR-342-5p能抑制I/R后心臟的凋亡信號[半胱天冬酶9(Caspase-9)及氨基末端激酶2抗體(JNK2)]并增強生存信號[磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)]表達，產生內源性心臟保護作用[18]。在氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)誘導下，HUVECs分泌富含miR-155外泌體，可促進單核/巨噬細胞由抗炎的M2型轉化為促炎的M1型，加重動脈粥樣硬化病變形成[19]。

1.2 血小板來源外泌體 血小板來源外泌體(platelet-derived exosomes，P-Exos)含有多種miRNA、血小板特有糖蛋白、細胞因子、凝血因子及生長因子，參與炎癥、血栓形成、組織損傷和修復、血管生成及動脈粥樣硬化等多種病理機制[20-23]。

有研究發(fā)現，富含miR-223的P-Exos具有心臟保護和抗炎作用，通過抑制細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-8、IL-12、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)等促炎介質釋放，減少動脈粥樣硬化斑塊形成并預防缺血性心臟微血管內皮細胞遷移和增殖[11，21]。通過抑制巨噬細胞CD36表達，P-Exos使巨噬細胞不能吞噬ox-LDL和膽固醇，減少泡沫細胞形成，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[24]。來自富血小板血漿的外泌體(PRP-Exos)不僅通過調控磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和MAPK-Erk信號通路及血管生成因子，促進內皮細胞增殖和遷移，誘導血管生成，還可激活轉錄共激活蛋白(YAP)，促進成纖維細胞增殖和遷移，增加膠原合成，促進傷口愈合[23]。

1.3 干細胞來源外泌體 干細胞來源的外泌體具有促進心肌細胞增殖、抑制細胞凋亡、促血管生成、抗纖維化、改善心功能等作用[25-27]。目前心血管領域研究較多的包括造血干細胞、間充質干細胞、心臟祖細胞及胚胎干細胞來源的外泌體。

CD34+造血干細胞分泌的外泌體富含促進血管生成的miR-126-3p，可調控血管內皮生長因子、血管生成素1、血管生成素2、基質金屬蛋白酶9和血小板反應蛋白1等血管生成通路中相關基因的表達，促進內皮細胞增殖及血管生成[25]。

間充質干細胞來源的外泌體(mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-Exos)在心血管疾病中具有旁分泌免疫調節(jié)、促血管生成、抗纖維化及增加心肌收縮力等作用[26]。有研究發(fā)現，MSC-Exos通過上調動脈粥樣硬化小鼠體內miR-let7水平，顯著抑制脂多糖誘導的M1型巨噬細胞表達，同時增加M2型巨噬細胞表達，減少動脈粥樣硬化小鼠斑塊面積及斑塊中巨噬細胞浸潤現象[28]。

心臟祖細胞(cardiac progenitor cell，CPC)是目前用于心臟修復的最佳干細胞類型之一，具有促進心肌細胞增殖、抑制細胞凋亡、促進血管生成、抗心肌纖維化、減少梗死面積和瘢痕形成的作用，CPC對心臟的有益作用主要通過其分泌的外泌體(CPC-Exos)實現[27]。CPC-Exos含有豐富的miRNA，有利于細胞之間信號傳遞，是功能表達的重要物質基礎。現已發(fā)現CPC-Exos中過表達的miRNA包括miR-132、miR-210、miR-21、miR-17、miR-103、miR-146a、miR-133a、miR-451、miR-20a、miR-15b、miR-181a和miR-323-5p，CPC-Exos通過這些miRNA在心臟疾病中發(fā)揮保護作用[27，29-30]。

胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)具有分化為機體所有細胞類型的能力，促進心肌細胞增殖和血管生成，抑制細胞凋亡，抗纖維化[11]。有研究發(fā)現，ESC來源的外泌體所含的miR-294能誘導心肌保護反應，促進心肌梗死后CPC存活和增殖，進而恢復急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)小鼠心肌功能[31]。

1.4 心肌細胞來源的外泌體 心肌細胞來源的外泌體含量及種類隨著細胞應激狀態(tài)不同而變化，在AMI、血管緊張素Ⅱ生成增加、缺氧、炎癥、損傷、葡萄糖饑餓或酒精過量等情況下，心肌細胞釋放外泌體增加，根據攜帶的miRNA不同對受損心臟產生的作用不同。有研究發(fā)現，2型糖尿病大鼠受損心肌釋放含有高水平的miR-320外泌體，心肌細胞通過外泌體將miR-320轉移到內皮細胞發(fā)揮抗血管生成的功能[32]；心肌梗死小鼠模型發(fā)現心肌源性細胞分泌的外泌體表達miR-146a，具有促進血管新生、保護心臟的功能[33]。

1.5 免疫細胞來源的外泌體 免疫細胞既可作為供體細胞分泌外泌體發(fā)揮生物效應，又可作為受體細胞與其他細胞來源的外泌體結合，誘導適應性免疫或體液免疫的發(fā)生。免疫細胞來源的外泌體已證明有助于抗原呈遞和免疫細胞調節(jié)，B細胞和樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)分泌的外泌體具有主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類和Ⅱ類功能，成熟DCs分泌的外泌體可將MHC-Ⅰ類蛋白復合物轉移至鄰近的DCs，增強免疫反應[30，34-35]。

成熟的DCs來源外泌體以類似于脂多糖方式，通過膜表面TNF-α介導的核因子κB(NF-κB)途徑誘發(fā)HUVECs炎癥，并能使ApoE-/-小鼠AS病變明顯加重[35]。單核/巨噬細胞來源的外泌體將miR-155轉移至內皮細胞中，上調ICAM-1、趨化因子配體2(CCL2)和IL-6等促炎因子表達，增強細胞間黏附，促進泡沫細胞形成[20，36]。一項研究發(fā)現，心肌梗死后M1型-巨噬細胞(促炎型)釋放大量外泌體(M1-Exos)，M1-Exos能抑制去乙?；?/腺苷酸活化蛋白激酶α2(Sirt1/AMPKɑ2)-內皮型一氧化氮合酶和Rac家族小GTP酶1-P21活化激酶2(RAC1-PAK2)信號通路，降低ECs血管生成能力，加重心肌損傷，抑制心臟愈合[37]。

1.6 脂肪組織來源的外泌體 正常情況下脂肪組織來源的外泌體(adipose-derived exosomes，Ad-Exos)被脂肪組織的巨噬細胞攝取，Ad-Exos中的三酰甘油被巨噬細胞分解為脂肪酸并將其釋放，維持機體全身代謝穩(wěn)態(tài)。當機體脂肪過多時這種平衡被打破，過多的Ad-Exos導致巨噬細胞活化、促進炎性因子釋放并導致全身胰島素抵抗[38]。

有研究發(fā)現，高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠內臟脂肪組織分離出的外泌體可下調ATP結合盒轉運體(ABCA1和ABCG1)介導的膽固醇外泄，顯著促進M1型巨噬細胞泡沫細胞生成，同時促炎性因子(TNF-α和IL-6)增加，導致動脈粥樣硬化病變加重[39]。一項研究發(fā)現，Ad-Exos中主要發(fā)揮作用的miRNA是miR-34a，它將營養(yǎng)超載信號傳遞給脂肪常駐巨噬細胞，從而通過抑制轉錄調節(jié)因子鋅指蛋白Krüppel樣因子4(Klf4)表達和巨噬細胞向M2型(抗炎型)極化，加劇肥胖誘導的全身炎癥和代謝失調[40]。

2 微粒(microparticles，MPs)

微粒是直徑為100 nm至1 μm的膜性小囊泡，由質膜以類似出芽方式產生。細胞雙層膜通過磷脂不對稱性分布維持脂質：靠近胞外空間側富含磷脂酰膽堿和鞘磷脂，而靠近胞質側主要由磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)和磷脂酰乙醇胺形成。細胞活化、凋亡或受到其他刺激時，細胞內Ca2+濃度增加激活了ATP介導的磷脂促翻轉酶，導致細胞雙層膜磷脂重新分布，即PS被轉運至外側膜，而磷脂酰膽堿被轉運至內側膜，促進質膜突起成泡。之后鈣蛋白酶被激活，降解成泡部位質膜的細胞骨架，使母細胞突起的膜作為獨立囊泡(包含母細胞的核酸、蛋白質和脂質)分裂到胞外空間[4，41]。

參與微粒形成的蛋白主要包括磷脂促翻轉酶、鈣蛋白酶、ADP-核糖基化因子6(ARF6)、細絲蛋白、踝蛋白、半胱天冬酶及凝溶膠蛋白；若微粒是以類似于病毒出芽方式從質膜脫落時，上述蛋白發(fā)揮作用同時還需TSG101及抑制蛋白域蛋白1(ARRDC1)參與[4，41]。關于微粒的研究主要集中于其表面含有地來源于母細胞特征性蛋白，但無論來源如何，由于生成過程中PS外移至微粒表面均帶有負電荷。

微粒具有強大的促凝作用，這是由于帶有負電荷的PS外翻后通過Ca2+結合活化的凝血因子，從而促進凝血酶產生[42]；微粒具有促炎及促進內皮功能障礙作用，這些均導致動脈粥樣硬化及血栓形成，而動脈粥樣硬化和血栓形成是多種心血管疾病發(fā)展的病理因素[41，43-44]。

2.1 內皮細胞微粒 高三酰甘油、糖尿病、高血壓和代謝綜合征等心血管疾病危險因素表達水平升高時，刺激內皮細胞釋放大量的內皮細胞微粒(endothelial microparticles，EMPs)[45-46]。EMPs發(fā)揮的作用主要是誘發(fā)炎癥[47]、促進凝血[41]，導致內皮功能障礙和血管生成[8]，促進動脈粥樣硬化進展和血栓形成[45]。

在微血管止血和血栓形成中EMPs發(fā)揮重要的作用。有研究發(fā)現，在動脈粥樣硬化中CD40L陽性表達的EMPs可增強內皮細胞增殖，促進體內新生血管形成，從而導致斑塊內出血[48]；另一方面EMPs促進纖溶酶原產生纖溶酶，使纖溶酶具有纖溶活性，起到溶解血栓作用[47]。

ox-LDL能刺激內皮細胞釋放攜帶ICAM-1的EMPs，增加內皮細胞與單核細胞黏附，促進小鼠主動脈斑塊形成[49]。來自衰老冠狀動脈內皮細胞和急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)病人EMPs通過血管緊張素Ⅱ誘導1型受體(AT1R)激活，從而導致還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶激活MAPKs和PI3K通路，誘導內皮細胞過早功能障礙、衰老和血栓形成[50]。

2.2 白細胞微粒(leukocyte microparticles，LMPs) LMPs來源于粒細胞、單核/巨噬細胞和淋巴細胞，具有促進炎癥反應、修飾內皮功能、促凝、促進血栓形成及易損斑塊內新生血管形成的作用[47，51]，幾乎參與動脈粥樣硬化形成的所有階段。

LMPs的共表達標記物是CD45，單核細胞、淋巴細胞和粒細胞釋放的微粒標記物分別是CD14、CD4和CD15[8，52]。有研究發(fā)現，與正常人比較，無癥狀亞臨床動脈粥樣硬化病人循環(huán)LMPs水平明顯增高[53]。Leroyer等[54]對動脈粥樣硬化病人微粒水平分析后發(fā)現，斑塊中微粒較血漿含量更多，微粒大多數來自白細胞(52.9%)，其中29.5%來自CD14+巨噬細胞，15.3%來自CD4+淋巴細胞，8.1%來自CD66b+粒細胞。與斑塊穩(wěn)定病人比較，有不穩(wěn)定斑塊的病人CD11b、CD66b、LMPs水平明顯增高，可獨立預測斑塊不穩(wěn)定性[55]。

LMP能增加IL-1β、IL-8、CD40配體、MHC Ⅰ類和MHC Ⅱ類蛋白復合物及ICAM-1表達，從而誘導白細胞激活、內皮細胞增殖、斑塊內新血管形成及單核細胞黏附和遷移[52-53]，加重動脈粥樣硬化病理活動，且動脈粥樣硬化血栓風險高的病人血流LMPs與血管壁長期接觸可能導致血管壁整體惡化[51]。

2.3 血小板微粒 血小板微粒(platelet microparticles，PMPs)是由活化的血小板釋放，具有凝血、止血和促進血栓形成的作用，心血管疾病病人外周血循環(huán)中PMPs水平高于冠狀動脈循環(huán)[56-57]。PMPs富含多種膜蛋白，這些膜蛋白(如GPⅠb、GPⅡb/Ⅲa、p-選擇素、整合素等)在凝血過程中發(fā)揮重要作用[41，58]。PMPs可促進內皮和單核細胞炎癥反應，在不利于血流條件下促進白細胞相互作用和單核細胞浸潤，并與LMPs共同促進血栓形成[59-61]。有研究表明，PMPs可直接與內皮細胞相互作用促進血管再生，或激活內皮祖細胞，促進內皮修復[36]。miR-142-3p在血小板和PMPs中均高度表達，可靶向內皮細胞促進內皮細胞增殖，參與高血壓病人內皮功能障礙[62]。

PMPs除是血小板活化的標志物外，還可增強血小板和纖維蛋白在動脈粥樣硬化動脈壁上沉積，促進血小板黏附，進一步補充血小板，促進血栓形成，參與動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)生發(fā)展[47，57]。除典型作用外，PMPs還參與創(chuàng)傷愈合、炎癥反應、糖尿病、關節(jié)炎、組織再生和癌癥等多種疾病過程[47，57]。

3 凋亡小體(apoptotic bodies，ApoBDs)

ApoBDs是凋亡細胞以細胞泡形式釋放到胞外空間，直徑為1～4 μm的膜性囊泡[2，59]。細胞凋亡時，細胞膜皺縮內陷形成囊泡，膜內包含凋亡核原料，表面標記物為碘化丙啶陽性和PS陽性[63]。根據細胞類型不同，凋亡膜突起從死亡細胞膜上以多種形式伸出，主要包括微管尖刺、凋亡原體和珠狀凋亡原體，這些突起釋放ApoBDs進入胞外液體中[9]。有研究表明，ApoBDs的形成有助于清除凋亡細胞，與其他EVs亞群一樣，ApoBDs具有轉運核酸或蛋白質等物質，促進細胞間通訊能力的作用[63-65]，但關于ApoBDs在心血管疾病中的研究較少。

4 EVs的臨床應用

由于EVs攜帶母細胞信息，在特定生理和病理條件下發(fā)生變化，并釋放到所有可檢測到的細胞外液中，因此，EVs一方面可作為多種疾病診斷和預警的生物標志物，另一方面可作為藥物載體或直接在治療中發(fā)揮作用。

4.1 在疾病診斷中作用 由于EVs在體液中獲取的簡便性，其有可能成為診斷心血管疾病的新方法。與正常人相比，冠心病病人血液CD31+、CD42+、EMPs和CD144+、EMPs水平均明顯增高，同時心肌梗死病人與心絞痛病人循環(huán)中兩種EMPs發(fā)現，心肌梗死病人循環(huán)中兩種EMPs表達量更高，結果提示CD31+、CD42+、EMPs和CD144+、EMPs對冠心病具有潛在的診斷價值[66-68]。一項研究證明，ACS病人血清外泌體miRNA-208a表達增高，且miRNA-208a表達水平越高的ACS病人生存率越低，提示miRNA-208a可能作為ACS診斷或預后指標[2，69]。

4.2 在治療中的作用 治療方面，EVs主要通過兩種途徑：一種是將已確定有治療作用的干細胞EVs直接干預疾病以達到治療目的，如大量臨床試驗已證明間充質干細胞或心臟祖細胞分泌的外泌體能保護心肌組織，抑制心肌細胞凋亡，改善心肌梗死后心功能[17，26，27]；另一種是利用EVs可跨越血腦屏障具有細胞靶向的特性將藥物裝載入EVs內應用于治療，這樣可保護藥物的生物信息物質免受降解酶破壞及在循環(huán)中的穩(wěn)定性[4，5，36]。

5 小結與展望

綜上所述，EVs含有豐富的母細胞來源的生物信息，可反映母細胞特定狀態(tài)，同時EVs可介導細胞間通訊，調節(jié)鄰近或遠端靶細胞功能，從而調節(jié)疾病的病理生理過程，并在心血管疾病進展中發(fā)揮重要作用?，F有研究證明，含有miRNA的外泌體或具有特異性蛋白的微粒在機體表達水平可預測心肌梗死、冠心病、糖尿病和腫瘤等，且由于EVs在體液中廣泛存在、獲取簡便，有望于成為心血管疾病的新型標志物。EVs在疾病的病理機制成為新的研究熱點，特別在細胞間、器官間通訊方面成為重要的信息交流載體，且EVs可將臨床和基礎相結合。目前EVs研究仍處于起步階段，且關于EVs的診斷及治療方面作用多是動物實驗及細胞實驗，同時由于臨床研究樣本量有限，得到的結論不具有說服力，且關于外泌體和微粒分離、檢測及純化的研究方法無統(tǒng)一標準，這使得人們對EVs在臨床應用中的認同不夠。針對這些問題，國際細胞外囊泡學會提出了EVs研究的最低限度指南(MISEV)[1]，該指南包括EVs命名法、收集和預處理、分離和純化、EVs表征、功能研究及實驗研究綜合報告6個要點，詳細介紹了關于EVs科學研究遵循的主要事項，強調了常見的誤解及方法學缺陷，為EVs研究制定了統(tǒng)一的國際規(guī)范。因此，臨床研究應遵循該指南，使EVs的研究更規(guī)范，從而更好地為臨床研究和基礎研究服務。