楊小英，陳春玲，馬曉聰，岳桂華

隨著經(jīng)濟發(fā)展和人們生活水平的改善，近50年來我國高血壓患病率為25.2%[1]，且隨著年齡增加發(fā)病率逐年增長，說明高血壓已成為心血管疾病一個危險的致病因素[2]。中醫(yī)學將高血壓歸屬于“眩暈”“頭痛”范疇，認為其發(fā)病機制為陰陽平衡失調(diào)所致，病位在肝、腎?！兜は姆ā分赋觯骸邦^暈，痰挾氣虛并火，治痰為主”；溫膽湯以治“痰”為主，化痰同時兼以安神。但溫膽湯治療高血壓機制尚未明確，加之溫膽湯治療高血壓文獻較少，導致其臨床應用受到一定限制。本研究運用網(wǎng)絡藥理學探討中藥溫膽湯治療高血壓的機制，為深入開展溫膽湯治療高血壓的作用機制提供研究基礎。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 以BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)對溫膽湯作用靶蛋白進行系統(tǒng)查詢。

1.2 方法 對預測的靶蛋白采用David 6.7在線數(shù)據(jù)庫進行基因本體(GO)功能、京都基因和基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析，同時基于BATMAN-TCM自身網(wǎng)絡繪制圖得出疾病-靶點-成分相關數(shù)據(jù)[3]。

2 結 果

2.1 預測靶蛋白選取 檢索的疾病分類中，查詢到高血壓預測靶蛋白共26種，分別是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、ADRA1D、ADRA2A、ADRA2B、ADRB1、ADRB2、ADRB3、ADRBK1、AGTR1、AGTR2、AVPR1A、BDKRB2、C3、CACNA1G、CACNA1I、CACNA2D1、CACNG1、CYBB、EDNRA、EPHX2、ITPR1、ITPR2、ITPR3、NCF1、OPRL1、REN。

2.2 差異靶基因的生物信息學分析

2.2.1 靶蛋白生物學過程(biological process，BP)分析 通過DAVID富集分析系統(tǒng)對本研究獲得的靶蛋白進行生物學過程分析。這些靶蛋白主要參與74種生物學過程，富集分析結果P<0.01的分子功能共33項，詳見表1。包括：腺苷酸活化環(huán)化腎上腺素受體信號通路、調(diào)節(jié)血管收縮、細胞內(nèi)鈣離子濃度的正調(diào)控、血壓調(diào)節(jié)、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、去甲腎上腺素-腎上腺素的血管舒張參與調(diào)節(jié)全身動脈血壓、發(fā)熱、腎素-血管緊張素調(diào)節(jié)醛固酮的產(chǎn)生、血小板激活、腺苷酸環(huán)化酶活性的激活、去甲腎上腺素分泌的負調(diào)控、膳食生熱作用、肌醇phosphate-mediated信號、胰島素分泌的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血管舒張、多細胞生物生長的負調(diào)控、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)生物合成過程的負調(diào)控、平滑肌收縮的調(diào)節(jié)、細胞間信號、離子跨膜轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)、棕色脂肪細胞分化、寒冷刺激、腺苷酸環(huán)化調(diào)控-G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、隔絕的鈣離子釋放到細胞質(zhì)、炎癥反應、心臟傳導調(diào)節(jié)、阿列素對G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號通路的脫敏作用、鈣離子傳輸、通過腎上腺素能受體信號通路激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性、腎上腺素分泌的負調(diào)控、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路介導的表皮生長因子激活受體失活、腎臟發(fā)育、腎素-血管緊張素對全身動脈血壓的調(diào)節(jié)。

表1 預測靶蛋白生物學過程分析

(續(xù)表)

2.2.2 預測靶蛋白生物細胞組件(cellular component，CC)分析 通過DAVID富集分析系統(tǒng)對獲得的靶蛋白進行生物細胞組件分析，這些蛋白包含13種細胞組分，富集分析結果P<0.01分子功能包括8項，詳見表2。包括質(zhì)膜的組成部分、電壓門控鈣通道復合體、血小板密集管狀網(wǎng)絡膜、等離子體膜、核內(nèi)體、受體復合物、肌漿網(wǎng)、膜的組成部分。

表2 預測靶蛋白生物細胞組件分析

2.2.3 預測靶基因蛋白分子功能(molecular function，MF)分析 通過DAVID富集分析系統(tǒng)對獲得的靶蛋白進行分子功能分析，靶蛋白參與21類分子途徑，其中P<0.01有13項，詳見表3。包括腎上腺素結合、肌醇1，4，5-三磷酸鹽敏感的鈣釋放通道活性、肌醇1，4，5-三磷酸結合、磷脂酰肌醇綁定、電壓門控鈣通道活性、鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、去甲腎上腺素結合、緩激肽受體結合、β-腎上腺素能反應、蛋白質(zhì)heterodimerization活動、低電壓門控鈣通道活性、血管緊張素Ⅱ型受體活性等。

表3 預測靶蛋白分子功能分析

(續(xù)表)

2.2.4 預測靶蛋白KEGG通路分析 通過KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)預測靶蛋白主要集中在13條信號轉(zhuǎn)導上，分析結果P<0.01有13項，詳見表4。包括鈣信號通路、腎素分泌、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)-環(huán)磷酸鳥苷酸依賴的蛋白激酶(PKG)信號通路、刺激神經(jīng)組織中的交互、唾液分泌、血管平滑肌收縮、心肌細胞的腎上腺素能信號、醛固酮的合成和分泌、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、催產(chǎn)素信號通路、細胞間隙連接、晝夜夾帶、炎癥介質(zhì)對TRP通道的調(diào)節(jié)。KEGG前5項信號通路示意圖見圖1～圖5。

表4 預測靶蛋白KEGG通路分析

圖1 Calcium signaling pathway信號轉(zhuǎn)導通路示意圖(標注五星位置為靶基因蛋白)

圖2 cGMP-PKG signaling pathway信號轉(zhuǎn)導通路示意圖(標注五星位置為靶基因蛋白)

圖3 Neuroactive ligand-receptor interaction信號轉(zhuǎn)導通路示意圖(標注五星位置為靶基因蛋白)

圖4 Renin secretion信號轉(zhuǎn)導通路示意圖(標注五星位置為靶基因蛋白)

圖5 Adrenergic signaling in cardiomyocytes信號轉(zhuǎn)導通路示意圖(標注五星位置為靶基因蛋白)

2.3 溫膽湯藥物靶點-通路-疾病靶點網(wǎng)絡的構建 基于BATMAN-TCM自身P<0.05，根據(jù)已知和預測的候選靶蛋白繪制網(wǎng)絡圖，每查詢一次中藥成分得分≥20分。在“簡化網(wǎng)絡視圖”中，僅顯示KEGG富集通路和OMIM/TTD疾病表型，與高血壓相關的預測靶蛋白的“靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡圖見圖6。

圖6 溫膽湯藥物靶點-通路-疾病靶點網(wǎng)絡圖

3 討 論

網(wǎng)絡藥理學是一門以系統(tǒng)生物學和多向藥理學為基礎，將網(wǎng)絡構建與分析技術合為一體后發(fā)展藥物研究的新方法和新理論技術[4-5]，為中醫(yī)藥的發(fā)展提供了新方向。中藥方劑是根據(jù)“君”“臣”“佐”“使”調(diào)和組成，中藥的復雜性與機體相互作用后，其復雜性、系統(tǒng)性等加重分子水平系統(tǒng)層次的困難，利用網(wǎng)絡分析方法，可逐步進行挖掘及適用的疾病范圍，從而構建化學成分-靶點-疾病網(wǎng)絡中心。目前網(wǎng)絡藥理學對中藥(復方)可從分子網(wǎng)絡角度進行闡述[6]，因此，本研究運用網(wǎng)絡藥理學對中藥溫膽湯進行分析，尋找高血壓疾病的重要靶蛋白及信號通路。

通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，溫膽湯治療高血壓關鍵在于26種靶蛋白，運用David 6.7在線GO富集分析、KEGG通路分析后發(fā)現(xiàn)，這些靶蛋白經(jīng)GO富集分析后，主要包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)、鈣離子通道、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、MAPK信號通路、細胞器及細胞質(zhì)膜、緩激肽、蛋白質(zhì)合成等作用；KEGG信號通路分析結果可知，這些靶蛋白主要與鈣信號通路、cGMP-PKG信號通路、刺激神經(jīng)組織中交互、腎素分泌、心肌細胞腎上腺素能信號傳導、唾液分泌、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、催產(chǎn)素信號通路、細胞間隙連接、晝夜夾帶、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)等相關，綜合結果可知，這26種靶蛋白參與高血壓調(diào)節(jié)主要與RAS、多種信號通路、炎性因子調(diào)控密切相關。

網(wǎng)絡構建靶點-通路-疾病圖發(fā)現(xiàn)，高血壓與靶蛋白網(wǎng)絡交接，且有些靶蛋白與其他疾病相互聯(lián)系，可知網(wǎng)絡藥理學為中醫(yī)中藥打開了廣闊的前景，需要進行深入研究；數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，認為靶蛋白ACE是RAS的關鍵酶，位于血管內(nèi)皮細胞膜性的糖蛋白，促使緩激肽分解代謝與血管緊張素Ⅱ產(chǎn)生，最終促使血管舒張，發(fā)揮降血壓作用。ACE促進血管平滑肌細胞增殖，從而改善血管血流動力學，但它可能造成醛固酮分泌增多，引起體內(nèi)水鈉潴留。因此，靶蛋白ACE在高血壓整個演變過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。ACE具有多態(tài)性，它是促進高血壓發(fā)展的一個重要蛋白；其DD和ID基因與高血壓密切相關，美國和日本的前期研究已證實[9]。有文獻報道，DD等位因型引起高血壓[10]。劉龍梅等[11]發(fā)現(xiàn)，原發(fā)高血壓病人DD等位基因型表達高于健康者；劉麗化[12]發(fā)現(xiàn)，高血壓病人ACE中DD型血漿濃度高，ID型和II型依次降低。因此認為，長期口服血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)可逆轉(zhuǎn)心室肥厚，降低高血壓帶來的危害。AGTR1、AGTR2蛋白是由腎素-血管緊張素調(diào)節(jié)；AGTR1與心血管疾病關聯(lián)較大，主要通過與血管緊張素Ⅱ結合后發(fā)揮血管收縮作用，以調(diào)節(jié)血壓和控制醛固酮釋放，因此，它在治療心血管疾病起著重要作用。AGTR1與高血壓有關的論述始于1994年Bonnardeau等[13]報道，國內(nèi)已有相關報道AGTR1蛋白A1166C多態(tài)性影響高血壓發(fā)展[14]。姚懿桐等[15]總結心血管疾病談及AGTR1的1166位點突變涉及高血壓；李雪冬等[16]證明AGTR1與高血壓有關，其主要與A1166C位點基因突變相關。這3個靶蛋白均與RAS相關，結合KEGG信號通路分析可知，RAS在高血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，RAS主要調(diào)節(jié)腎臟水-電解質(zhì)平衡、血壓平衡、促細胞生長和心血管結構的保護等作用[17]。過度激活RAS，心血管疾病可能首先發(fā)生，如高血壓、心力衰竭等；RAS中Ang(1～7)表達量增高同時與Mas受體結合可較好地保護心臟、腦血管，有利于逆轉(zhuǎn)高血壓導致的靶器官損傷。因此，RAS認為是機體內(nèi)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一。

數(shù)據(jù)挖掘中發(fā)現(xiàn)，離子通道在高血壓疾病中發(fā)揮較明顯作用，鈣離子通道為首，是近年來研究高血壓機制的一個重點。鈣離子通道主要以L型為主，其儲存在心臟和血管中，調(diào)控心肌收縮、竇房結功能和血管張力。采用鈣離子通道阻滯劑治療高血壓可有效阻滯鈣離子內(nèi)流，改善血管順應性，舒張血管平滑肌后釋放緩激前列腺素等擴血管活性藥物，從而降低外周血管阻力，產(chǎn)生降壓作用[18]。目前使用的鈣離子通道阻滯劑類藥物也是運用這一作用降血壓。其次，cGMP-PKG信號通路主導著高血壓；cGMP廣泛存在于細胞內(nèi)同時參與第二信使生理作用，心血管疾病中使一氧化氮發(fā)揮松弛血管平滑肌作用[19-20]，其下游因子PKG參與血壓調(diào)節(jié)的作用，已有研究表明，PKG1可升高細胞內(nèi)鈣離子濃度，從而影響血壓[21]。施偉麗等[22]研究顯示，cGMP-PKG信號通路活化可降低自發(fā)性高血壓水平。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，CACNA1G、CACNA1I、CACNA2D1均屬于CACNA類別，其CACNA1C在研究中發(fā)現(xiàn)與心血管疾病密切聯(lián)系，但上述蛋白在心血管疾病方面目前未見報道，而本研究結果可為今后的臨床試驗開展奠定基礎。G蛋白偶聯(lián)受體信號通路是RAS中重要組成成分，其是腎素配體的關聯(lián)通道，RAS啟動離不開G蛋白偶聯(lián)受體信號通路，炎癥通路信號影響高血壓機制，血管內(nèi)皮細胞與白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子(TNF)、C反應蛋白(CRP)相關。劉振岳等[23]研究證實，高血壓早期階段炎癥損傷是典型的，且貫穿于整個疾病階段，而影響高血壓的炎性因子是CRP、IL-6、TNF-α水平，且炎性因子升高時將誘發(fā)機體合成細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、IL-4抑炎因子。趙定學等[24]研究發(fā)現(xiàn)，炎性因子IL-6、IL-8、TNF、CRP升高不僅影響血壓，還能影響血脂變化，因此，炎癥通路對高血壓起著重要作用。

綜上所述，溫膽湯治療高血壓主要以腎素-血管緊張素為主，其次與cGMP-PKG信號通路、鈣離子信號通路、炎癥通路相輔相成共同調(diào)節(jié)；關鍵靶蛋白ACE、AGTR1貫穿于整個疾病發(fā)生、發(fā)展。今后研究將逐步驗證本研究挖掘的靶蛋白，進一步分析其在哪一節(jié)點發(fā)揮治療作用，為中藥復方多因、多效、多靶點的作用機制提供借鑒。