徐江林，林 謙，劉 靜，萬 潔，崔曉云，紀(jì) 翔，毛天詩，張 卓，逯金金

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)簡稱冠心病，是由于冠狀動脈狹窄導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血、缺氧或壞死而引起的心臟病[1]?！吨袊难芙】蹬c疾病報告2019概要》指出，我國有約1 100萬例心力衰竭病人，患病率、死亡率均呈上升趨勢[2]。冠心病嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量，給社會、經(jīng)濟(jì)帶來巨大負(fù)擔(dān)，且長期單純使用西藥治療存在一定的副作用。近年來，新藥研發(fā)領(lǐng)域方面，天然藥物化學(xué)成分受到學(xué)者重視，天然產(chǎn)物是治療疾病和研發(fā)藥物的重要化合物來源[3]。槲皮素(Quercetin)又稱為槲皮黃素、櫟精，是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于自然界中，可從植物花、葉、果實中提取得到，且存在于多種中藥中，如黃芪、三七等?，F(xiàn)代藥理研究表明，槲皮素通過抗氧化、抗炎等作用減輕冠心病心臟損傷[4]。目前關(guān)于槲皮素治療冠心病的作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種新型的藥物研究方法，可全面、系統(tǒng)地分析藥物與疾病的關(guān)系，為研究藥物內(nèi)部復(fù)雜的分子機(jī)制提供有力的工具[5]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討槲皮素治療冠心病的分子機(jī)制，為今后基礎(chǔ)研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 槲皮素潛在靶點的獲取 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺[Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)][6]、Pharm Mapper (http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)數(shù)據(jù)庫[7]和Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫[8]檢索及預(yù)測，通過UniProt數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)校正靶點名稱為專業(yè)學(xué)術(shù)名稱，由此獲得槲皮素的潛在靶點。

1.2 冠心病的相關(guān)靶點收集 以“coronaryheart disease”為關(guān)鍵詞，分別檢索DisGeNET(http://www.disgenet.org/)[9]和GeneCards(https://www.genecards.org/)[10]數(shù)據(jù)庫，獲取冠心病相關(guān)靶點。

1.3 槲皮素治療冠心病的共同靶點 通過在線軟件作圖工具InteractiVenn構(gòu)建Venn圖，得到槲皮素-冠心病的共同靶點。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將槲皮素-冠心病共同靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)[11]，以高置信度(high confidence>0.7)進(jìn)行篩選，隱藏網(wǎng)絡(luò)中無關(guān)聯(lián)節(jié)點，將結(jié)果文件保存為tsv格式，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，使用cytoHubba插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，篩選槲皮素治療冠心病的關(guān)鍵靶點。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)功能與京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 將槲皮素-冠心病的共同靶點輸入Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/gp/index.html)[12]，進(jìn)行GO功能與KEGG通路富集分析。GO功能分析得到生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子功能和生物功能，用于描述基因靶點功能。KEGG通路富集分析得到槲皮素-冠心病共同靶點所富集的信號通路。

1.6 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“槲皮素-共同靶點-冠心病”網(wǎng)絡(luò)和“槲皮素-關(guān)鍵靶點-主要通路-冠心病網(wǎng)絡(luò)”，槲皮素、冠心病和相關(guān)靶點以“節(jié)點”顯示，節(jié)點之間相互作用以“邊”顯示。使用Network Analyzer插件計算“槲皮素-關(guān)鍵靶點-主要通路-冠心病網(wǎng)絡(luò)”中節(jié)點自由度(Degree)。

1.7 分子對接 將得到的核心成分與關(guān)鍵靶點進(jìn)行分子對接，得到對接親和力以反映分子間的結(jié)合穩(wěn)固性。從PDB數(shù)據(jù)庫下載蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，TCMSP下載化合物的結(jié)構(gòu)，使用PyMol 2.4.0和Auto Dock Tools軟件對蛋白質(zhì)、化合物進(jìn)行處理，Auto Dock Vina軟件進(jìn)行分子對接，PyMol 2.4.0進(jìn)行可視化[13-14]。

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素的潛在靶點 通過TCMSP、PharmMapper和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫檢索及預(yù)測，刪除重復(fù)數(shù)據(jù)后共得到459個槲皮素的潛在靶點。

2.2 冠心病的相關(guān)靶點 以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞檢索GeneCards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫，收集靶點并去除重復(fù)數(shù)據(jù)后共得到2366個冠心病的相關(guān)靶點。

2.3 槲皮素-冠心病的共同靶點 將459個槲皮素潛在靶點和2 366個冠心病相關(guān)靶點輸入在線軟件作圖工具InteractiVenn，繪制Venn圖，取交集后共得到槲皮素-冠心病共同靶點233個。詳見圖1。

圖1 槲皮素-冠心病共同靶點的Venn圖

2.4 槲皮素-共同靶點-冠心病網(wǎng)絡(luò) 將槲皮素、冠心病及233個共同靶點輸入Cytoscape 3.7.2軟件，得到槲皮素-共同靶點-冠心病網(wǎng)絡(luò)，共235個節(jié)點和466條邊。詳見圖2。

圖2 槲皮素-共同靶點-冠心病網(wǎng)絡(luò)圖(綠色節(jié)點代表槲皮素，紫色節(jié)點代表冠心病，紅色節(jié)點代表共同靶點)

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)及槲皮素治療冠心病的關(guān)鍵靶點 使用cytoHubba插件根據(jù)Degree對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，得到5個槲皮素治療冠心病的關(guān)鍵靶點，詳見表1。將槲皮素-冠心病共同靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，通過高置信度(>0.7)篩選得到PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)包含224個節(jié)點和1 915條邊，詳見圖3。

表1 槲皮素治療冠心病的關(guān)鍵靶點信息表

圖3 槲皮素治療冠心病的關(guān)鍵靶點

2.6 GO功能和KEGG通路富集分析 GO功能富集分析結(jié)果顯示，生物學(xué)過程主要集中在創(chuàng)傷反應(yīng)(responsetowounding)、脂多糖反應(yīng)(responseto lipopolysaccharide)、凋亡信號通路(apoptotic signaling pathway)、有毒物質(zhì)反應(yīng)(response to toxic substance)、細(xì)胞運(yùn)動正調(diào)節(jié)(positive regulation of cell motility)；細(xì)胞組分主要集中在囊泡腔(vesicle lumen)、膜筏(membrane raft)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)、細(xì)胞頂端(apical part of cell)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域(perinuclear region of cytoplasm)；分子功能主要集中在蛋白激酶活性(protein kinase activity)、內(nèi)肽酶活性(endopeptidase activity)、輔因子結(jié)合(cofactorbinding)、激酶結(jié)合(kinase binding)、蛋白質(zhì)同源二聚化活性(protein homodimerization activity)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，通路主要富集在癌癥(pathways in cancer)、糖尿病并發(fā)癥晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)及其受體(RAGE)信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路(HIF-1 signaling pathway)、鉑耐藥(Platinum drug resistance)。詳見圖4。

圖4 GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果(排名前20)

2.7 槲皮素-關(guān)鍵靶點-主要通路-冠心病網(wǎng)絡(luò) 網(wǎng)絡(luò)中共17個節(jié)點和44條邊，綠色節(jié)點代表槲皮素，紫色節(jié)點代表關(guān)鍵靶點，紅色節(jié)點代表主要通路，黃色節(jié)點代表冠心病。節(jié)點的形狀和字體大小、顏色深度與Degree呈正相關(guān)。詳見圖5。

圖5 槲皮素-關(guān)鍵靶點-主要通路-冠心病網(wǎng)絡(luò)圖

2.8 分子對接分析 將槲皮素與5個關(guān)鍵靶點進(jìn)行分子對接，得到平均對接親和力為-7.9 kcal/mol，詳見表2。對接親和力越小，提示配體與受體蛋白結(jié)合越穩(wěn)定，表明槲皮素與關(guān)鍵靶點具有較強(qiáng)的結(jié)合力。槲皮素與AKT1分子對接結(jié)果最佳，對接模式見圖6。左側(cè)圖中黃色分子為槲皮素，顯示槲皮素可與AKT1中相互作用的氨基酸殘基形成界面的活性口袋分子匹配，右側(cè)圖片顯示對接部分的細(xì)節(jié)。

表2 分子對接結(jié)果

圖6 槲皮素與AKT1分子對接模式圖

3 討 論

冠心病歸屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”等范疇，基本病機(jī)以氣虛為本、血瘀為標(biāo)。槲皮素是典型的天然黃酮類化合物，常用益氣活血中藥如黃芪、三七等治療，有研究表明，槲皮素通過降低氧化應(yīng)激，抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)，抑制體內(nèi)細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌免受缺血再灌注損傷[15]。Dong等[16]發(fā)現(xiàn)，槲皮素可能通過下調(diào)HMGB1-TLR4-NF-κB信號通路，抑制細(xì)胞炎性因子產(chǎn)生，改善冠狀動脈結(jié)扎大鼠及H9C2細(xì)胞的缺血再灌注損傷，但深層機(jī)制需進(jìn)一步探討。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討槲皮素治療冠心病的分子機(jī)制。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素可能通過233個靶點作用于冠心病。通過對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析，得到槲皮素治療冠心病的5個關(guān)鍵靶點，分別是AKT1、TP53、MAPK1、IL-6、VEGFA。AKT是調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能的復(fù)雜信號通路中心，分為3種亞型AKT1、AKT2和AKT3。其中，AKT1在心腦組織中表達(dá)最豐富，敲除AKT1基因?qū)е聞用}粥樣硬化小鼠模型的血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移減少，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加，增加斑塊易損性，導(dǎo)致嚴(yán)重動脈粥樣硬化和閉塞性冠狀動脈疾病[17]。AKT1通過AKT1-eNOS信號軸調(diào)控一氧化氮(NO)產(chǎn)生，減輕缺血再灌注對心肌細(xì)胞損傷[18]。TP53是一種抑癌基因蛋白，具有抑癌和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡作用。TP53基因突變可抑制細(xì)胞凋亡導(dǎo)致動脈粥樣硬化，且與冠心病發(fā)生密切相關(guān)[19-20]。MAPK1基因又稱為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2(extracellular signal-regulated kinases，ERK2)基因，參與ERK1/2信號通路及增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等多種細(xì)胞進(jìn)程。相關(guān)研究表明，MAPK-1/HIF1/HO-1基因多態(tài)性與圍絕經(jīng)期冠心病顯著相關(guān)[21-22]。Chen等[23]研究發(fā)現(xiàn)，抑制ERK1/2信號通路和激活肝X受體(liver X receptor)可能通過保護(hù)動脈完整性，防止巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞形成及增強(qiáng)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)等多種機(jī)制減輕動脈粥樣硬化。IL-6是促炎性細(xì)胞因子的一種，參與各種炎癥和免疫反應(yīng)，Bernberg等[24]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激通過增加IL-6釋放進(jìn)而促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)展。VEGFA是一種血管內(nèi)皮生長因子，主要參與調(diào)控血管生成，Zou等[25]研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA通過增加活性氧的生成及增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的自噬，促進(jìn)急性心肌梗死后血管生成，從而改善缺血性心肌病。

KEGG通路分析主要富集在癌癥、糖尿病并發(fā)癥晚期AGE及其受體(RAGE)信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路、鉑耐藥。持續(xù)性高血糖形成蛋白內(nèi)交聯(lián)而產(chǎn)生AGEs，AGEs直接參與動脈粥樣硬化和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)，對內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)、血管平滑肌細(xì)胞功能和血小板活性產(chǎn)生有害作用，增強(qiáng)炎癥和氧化應(yīng)激，在冠心病的病理生理中發(fā)揮重要作用[26-28]。MAPK信號通路包括4個級聯(lián)反應(yīng)：p38-MAPKs、Jun氨基末端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號相關(guān)激酶1/2(ERK1/2)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)，調(diào)控細(xì)胞生長、炎癥、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等多種過程[29]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，p38-MAPK的激活通過磷酸化活化核因子-κB(NF-κB)，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞過度表達(dá)促炎細(xì)胞因子，加重炎性損傷，促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)展[30]。HIF-1廣泛參與多種細(xì)胞信號通路，是介導(dǎo)缺氧信號傳導(dǎo)的中樞，其中HIF-1α主要調(diào)節(jié)氧氣穩(wěn)態(tài)，在缺氧性損傷中發(fā)揮重要作用[31]。冠心病病人HIF-1α蛋白表達(dá)增加，與冠心病的發(fā)生密切相關(guān)[32]。Liu等[33]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR138靶向HIF1-α，可抑制心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的線粒體凋亡，從而減小心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致的心肌梗死范圍。癌癥通路包括MAPK信號通路、VEGF信號通路、p53信號通路、PI3k-AKT信號通路等。持續(xù)激活JNK和ERK1/2通路可增加癌細(xì)胞對鉑類藥物的耐藥性[34]。

GO分析中，生物學(xué)過程主要與創(chuàng)傷反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、凋亡信號通路、有毒物質(zhì)反應(yīng)、細(xì)胞運(yùn)動正調(diào)節(jié)相關(guān)，與上述通路介導(dǎo)的生物學(xué)過程相符。分子對接結(jié)果顯示，所有對接配對具有良好的對接親和力，從分子角度進(jìn)一步驗證了槲皮素對冠心病靶點的調(diào)節(jié)作用，同時證明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的可靠性。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理方法探討槲皮素治療冠心病的潛在機(jī)制，確定槲皮素治療冠心病的關(guān)鍵靶點、主要生物學(xué)過程及主要通路，為基礎(chǔ)研究提供方向。