胡鑫麗，張文慧，王瑞君，王博文，陳星旭，宋維芳

山西醫(yī)科大學汾陽學院，山西汾陽032200

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fattyliver disease，NAFLD）已成為世界范圍內(nèi)最常見的慢性肝臟疾病，且正迅速成為終末期肝病及肝移植的主要原因［1-2］。非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是一種嚴重 NAFLD 的進展形式［2］，以肝細胞脂肪變性、肝細胞損傷、不同程度的肝臟炎癥及纖維化為特征［3］，其病死率高，若不干預治療，將不可逆地進一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌［4］，因此，控制NASH 的發(fā)生發(fā)展逐漸引起臨床治療的重視。目前導致進行性NASH 發(fā)生發(fā)展的因素尚不清楚，臨床發(fā)現(xiàn)NASH 患者肝臟中的膽固醇含量明顯升高［5］，另外，有研究表明，過量的膳食膽固醇升高會導致動物模型實驗性NASH 的發(fā)生［6-7］，表明膽固醇穩(wěn)態(tài)的改變及肝內(nèi)膽固醇的積累在NASH 發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［8］。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2（sterol regulatory elementbinding protein 2，SREBP-2）是膽固醇穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，其活性形式n-SREBP-2 直接調(diào)控的下游基因分別為3-羥基 3-甲基戊二酰輔酶 A 還原酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase，HMGCR）和低密度脂蛋白受體（low-density lipoproteins receptor，LDLR），其中，HMGCR 是肝臟內(nèi)源性膽固醇合成的限速酶［9］，LDLR 主要負責將載脂蛋白低密度脂蛋白（lowdensity lipoproteins，LDL）結(jié)合的外源膽固醇轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)［10］。研究表明，NALFD 與 SREBP-2 成熟及HMGCR 增加有關(guān)［11-12］。但動態(tài)觀察高膽固醇攝食破壞肝臟膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)并促使NASH 發(fā)生發(fā)展的作用尚未見報道。

本研究通過建立高脂高膽固醇誘導的NASH模型，在動物水平及細胞水平探討膽固醇在高脂高膽固醇誘導NASH 發(fā)生發(fā)展過程中的動態(tài)作用，為NASH 的防治提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD 大鼠100 只，雄性，體重180 ～200 g，6 周齡，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（晉）2015-0001。

1.2 細胞 人肝臟正常細胞HL-7702 系由清華大學醫(yī)學院醫(yī)學系統(tǒng)生物學研究中心惠贈。

1.3 主要試劑 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性測定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）及甘油三酯（triglyceride，TG）含量測定試劑盒均購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；Masson 三色染色液試劑盒及油紅O 染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠SREBP-2 及HMGCR 多克隆抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；兔抗鼠LDLR 多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠GAPDH 多克隆抗體購自上海斯信生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）、HRP標記的羊抗兔IgG 及RPMI1640 培養(yǎng)基均購自武漢博士德生物工程有限公司；油酸（oleic acid，OA）購自上海易恩化學技術(shù)有限公司；LDL-膽固醇（LDLC）購自北京協(xié)生生物科技有限責任公司。

1.4 動物試驗 100 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為 5 組：CON 組（正常飲食）、HFC0 組（20%脂肪）、HFC1 組（20%脂肪 + 1%膽固醇）、HFC2 組（20%脂肪+ 2%膽固醇）和HFC5 組（20%脂肪+ 5%膽固醇），每組 20 只。于飼喂第 4、6、8、12 周末，各組分別處理5 只大鼠。大鼠禁食24 h，自由飲水，麻醉后暴露腹腔經(jīng)腹主動脈采血，常溫4 000 × g 離心10 min，分離血漿，檢測血漿中ALT 及AST 含量；剖解取出肝臟沖洗干凈，取肝右葉相同部位組織，用4%多聚甲醛溶液固定，制備切片，HE 及Masson 染色，觀察肝臟組織病理情況；檢測肝臟組織中TC、TG含量；提取肝臟組織蛋白，進行Western blot 檢測。剩余肝臟組織經(jīng)液氮速凍后，-80 ℃保存。

1.5 細胞實驗 將對數(shù)生長期的HL-7702 細胞接種至6 孔板，隨機分為3 組：對照組（含10% FBS RPMI1640 培養(yǎng)基）、OA 組（添加 200 μmol ／ L OA 的含 10% FBS RPMI1640 培養(yǎng)基）、OA + LDL-C 組（添加 200 μmol ／ L OA 及 50 μg ／ mL LDL-C 的含 10%FBS RPMI1640 培養(yǎng)基）。同時再設(shè)3 個平行對照組，在細胞培養(yǎng)5 d 后，檢測細胞培養(yǎng)液中ALT 及AST 含量；第1 平行對照組細胞進行油紅O 染色，觀察細胞內(nèi)脂滴堆積的位置、形態(tài)及大小；第2 平行對照組細胞進行菲律賓菌素染色，觀察細胞內(nèi)游離膽固醇的分布及含量；第3 平行對照組細胞用RIPA裂解法提取蛋白，進行Western blot 檢測；第4 平行對照組檢測細胞內(nèi)TC、TG 含量。

1.6 各項檢測

1.6.1 ALT、AST、TC、TG檢測 均按試劑盒說明書操作。

1.6.2 HE 及 Masson 染色 HE 染色：切片常規(guī)脫蠟至水后，蘇木素染液染色3 ～5 min；自來水沖洗1 ～2 min；1%鹽酸酒精溶液分化數(shù)秒，自來水沖洗回藍5 ～ 10 min；切片入伊紅溶液 10 ～ 30 s；再經(jīng) 95%乙醇Ⅰ、Ⅱ中各調(diào)色約10 s；將切片放入無水乙醇Ⅰ、Ⅱ中各脫水1 ～2 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明1 ～2 min；中性樹膠封片，鏡檢。Masson 染色：切片常規(guī)脫蠟至水后，按Masson 三色染色液試劑盒說明書進行切片染色，封片后顯微鏡下觀察。

1.6.3 油紅O 及菲律賓菌素染色 細胞誘導5 d 后棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌，用4%多聚甲醛固定30 min；棄去固定液，PBS 洗滌，油紅O 染液染色20 min；60%異丙醇漂洗除去多余染料，蘇木素染液復染1 min；自來水沖洗至變藍，加入PBS，顯微鏡下觀察。同理，細胞棄去固定液，經(jīng)PBS 洗滌后，用1.5 mg／mL 甘氨酸室溫培養(yǎng)10 min；PBS 洗滌3 次，避光條件下菲律賓染液染色2 h；加入PBS，熒光顯微鏡下觀察。

1.6.4 Western blot 蛋白經(jīng)8% ～10% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜2 h；加入5%脫脂牛奶，室溫封閉2 h；分別加入 SREBP-2 抗體（1 ∶1 000 稀釋）、HMGCR 抗體（1 ∶1 000 稀釋）、LDLR 抗體（1 ∶1 000 稀釋）及GAPDH 抗體（1 ∶5 000 稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌 3 次，加入 HRP 標記的羊抗兔 IgG（1 ∶5 000 稀釋），室溫孵育 2 h；TBST 洗膜 3 次，采用化學發(fā)光法顯影，ImageLab 分析條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗結(jié)果以表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩獨立樣本比較采用t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 動物試驗

2.1.1 血漿中 ALT、AST 及肝臟組織中 TC、TG 的含量結(jié)果顯示，飼喂 12 周后，與 CON 組比較，HFC0 組、HFC1組、HFC2 組及HFC5 組血漿中ALT 含量均顯著升高（t 分別為 -12.892、-17.712、-23.038 和 -48.790，P均 ＜ 0.01），AST 含量均顯著升高（t 分別為-5.391、-6.407、-6.702 和-9.905，P 均 ＜ 0.01）。與 CON 組比較，HFC1 組、HFC2 組和 HFC5 組肝臟組織中 TC 含量均顯著升高（t 分別為 -39.450、-19.232 和 -98.024，P 均 ＜ 0.05），HFC0 組、HFC1 組、HFC2 組、HFC5 組肝臟組織中TG 含量均顯著升高（t 分別為-4.732、-4.498、-15.780 和-16.909，P 均 ＜ 0.05）。見表 1。

2.1.2 肝臟組織病理學觀察 12 周末，HE 染色觀察顯示，CON 組肝細胞形態(tài)正常，胞質(zhì)均勻，肝小葉結(jié)構(gòu)規(guī)則，HFC0 組、HFC1 組表現(xiàn)為散在的肝細胞漿內(nèi)脂滴空泡的形成，HFC2 組及HFC5 組以大脂滴為主的脂肪變性肝細胞和氣球樣變性肝細胞增多，肝細胞腫脹，胞質(zhì)疏松化；Masson 染色觀察顯示，HFC2 組肝細胞周圍有散在分布的細絲狀淡藍色纖維出現(xiàn)，HFC5 組可見分布較廣、較粗的藍色膠原纖維沉積。見圖1。

2.1.3 Western blot 分析 4 周末，與 CON 組比較，HFC2 組及HFC5 組LDLR 蛋白表達水平均顯著升高（t 分別為-3.748 和-4.001，P 均 ＜ 0.05）。6 周末，與 CON 組比較，HFC1 組、HFC2 組、HFC5 組LDLR蛋白表達水平均顯著升高（t 分別為-7.617、-5.575和 -5.390，P 均 ＜ 0.05）；與 HFC0 組比較，HFC1組、HFC2 組、HFC5 組均顯著升高（t 分別為-9.247、-7.530和-7.689，P 均 ＜ 0.05）。8 周末，與 CON 組比較，HFC1 組、HFC2 組、HFC5 組 LDLR 蛋白表達水平均顯著升高（t 分別為-3.529、-4.916 和-3.950，P 均 ＜0.05）；與 HFC0 組比較，HFC1 組、HFC2 組、HFC5組均顯著升高（t 分別為-3.711、-5.306 和-4.222，P 均 ＜ 0.05）。12 周末，HFC5 組較 CON 組 LDLR蛋白表達水平均顯著降低（t=8.065，P ＜ 0.05）。4、6及8 周末，所有高脂組與CON 組比較n-SREBP-2 蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（t 為0.043 ～1.532，P 均 ＞ 0.05）。12 周末，與 CON 組比較，HFC0 組、HFC2 組及HFC5 組n-SREBP-2 蛋白表達水平均顯著升高（t 分別為 -7.288、-4.120 和 -5.550；P 均 ＜0.05）；與 HFC0 組比較，HFC1 組、HFC2 組及 HFC5組均顯著降低（t 分別為 7.446、3.422 和 2.912，P均 ＜ 0.05）。4、6 及 12 周末，所有高脂組與 CON 組比較，HMGCR 蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（t為-4.919 ～ 9.192，P 均 ＞ 0.05）。8 周末，HFC5組較CON 組HMGCR 蛋白表達水平顯著降低（t =21.079，P ＜ 0.05）。見圖 2 ～ 9。

2.2 細胞試驗

2.2.1 培養(yǎng)液中 ALT、AST 及細胞內(nèi) TC、TG 的含量 結(jié)果顯示，與對照組比較，OA 組及OA+LDL-C 組細胞培養(yǎng)液中ALT 含量顯著升高（t 分別為-6.675和-3.834，P 均 ＜ 0.05），OA + LDL-C 組 AST 含量顯著升高（t = -2.663，P ＜ 0.05），見圖 10。與對照組及OA 組比較，OA + LDL-C 組細胞內(nèi)TC 含量顯著升高（t 分別為-135.682 和-201.249，P 均 ＜ 0.01）；各組細胞中TG 含量差異無統(tǒng)計學意義（t 均為-0.06，P 均 ＞ 0.05），見圖 11。

表 1 12 周末各組大鼠血漿中 ALT、AST 及肝臟組織中 TC、TG 的含量（，n = 5）Tab.1 Contents of ALT and AST in plasma and TC and TG in liver of rats in various groups at the end of week 12 after feeding（，n = 5）

表 1 12 周末各組大鼠血漿中 ALT、AST 及肝臟組織中 TC、TG 的含量（，n = 5）Tab.1 Contents of ALT and AST in plasma and TC and TG in liver of rats in various groups at the end of week 12 after feeding（，n = 5）

注：與 CON 組比較，a 表示 P ＜ 0.05；aa 表示 P ＜ 0.01。

ALT［nmol ／（min·mL）］AST［nmol ／（min·mL）］TC（mg ／ g） TG（mg ／ g）162.90 ± 1.56 51.52 ± 0.84 7.83 ± 0.03 31.14 ± 1.16 HFC0 186.21 ± 0.91aa 56.29 ± 0.66aa 9.55 ± 0.74 45.10 ± 2.51a HFC1 200.60 ± 1.45aa 56.32 ± 0.34aa 14.14 ± 0.16aa 45.41 ± 2.97a HFC2 252.10 ± 3.41aa 57.68 ± 0.66aa 19.32 ± 0.61aa 49.58 ± 1.00aa HFC5 274.80 ± 1.68aa 60.81 ± 0.61aa 21.90 ± 0.14aa 46.76 ± 0.75aa

圖1 12 周末各組大鼠肝臟組織病理學顯微鏡觀察Fig.1 Microscopy of histopathology of livers of rats in various groups at the end of week 12 after feeding

圖2 4 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR、n-SREBP-2 及HMGCR 蛋白表達水平的Western blot 檢測Fig.2 Determination of expression levels of LDLR，n-SREBP-2 and HMGCR in liver of rats in various groups at the end of week 4 by Western blot

圖3 4 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR（A）、n-SREBP-2（B）及HMGCR（C）蛋白的表達水平Fig.3 LDLR（A），n-SREBP-2（B）and HMGCR（C）levels in livers of rats in various groups at the end of week 4 after feeding

圖4 6 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR、n-SREBP-2 及HMGCR 蛋白表達水平的Western blot 檢測Fig.4 Determination of expression levels of LDLR，n-SREBP-2 and HMGCR in livers of rats in various groups at the end of week 6 after feeding by Western blot

圖5 6 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR（A）、n-SREBP-2（B）及HMGCR（C）蛋白的表達水平Fig.5 LDLR（A），n-SREBP-2（B）and HMGCR（C）levels in livers of rats in various groups at the end of week 6 after feeding

圖6 8 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR、n-SREBP-2 及HMGCR 蛋白表達水平的Western blot 檢測Fig.6 Determination of expression levels of LDLR，n-SREBP-2 and HMGCR in livers of rats in various groups at the end of week 8 after feeding by Western blot

圖7 8 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR（A）、n-SREBP-2（B）及 HMGCR（C）蛋白的表達水平Fig.7 LDLR（A），n-SREBP-2（B）and HMGCR（C）levels in livers of rats in various groups at the end of week 8 after feeding

圖8 12 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR、n-SREBP-2 及HMGCR 蛋白表達水平的Western blot 檢測Fig.8 Determination of expression levels of LDLR，n-SREBP-2 and HMGCR in livers of rats in various groups at the end of week 12 after feeding by Western blot

圖9 12 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR（A）、n-SREBP-2（B）及 HMGCR（C）蛋白的表達水平Fig.9 LDLR（A），n-SREBP-2（B）and HMGCR（C）levels in livers of rats in various groups at the end of week 12 after feeding

圖 10 各組細胞培養(yǎng)液中ALT（A）及AST（B）的含量Fig.10 ALT（A）and AST（B）contents in media of various groups

圖 11 各組 HL-7702 細胞中 TC（A）及 TG（B）的含量Fig.11 TC（A）and TG（B）contents in HL-7702 cells of various groups

2.2.2 油紅O 染色 OA + LDL-C 組較對照組及OA 組富含脂滴的HL-7702 細胞數(shù)量增多，細胞內(nèi)脂滴增大，見圖12。

圖 12 油紅O 染色的對照組（A）、OA 組（B）及 OA+LDL-C組（C）HL-7702 細胞內(nèi)脂滴的顯微鏡觀察（× 400）Fig.12 Microscopy of lipid contents in HL-7702 cells in CON（A），OA（B）and OA + LDL-C（C）groups with oil red staining（× 400）

2.2.3 菲律賓菌素染色 OA + LDL-C 組細胞質(zhì)內(nèi)散在分布的熒光亮點較對照組及OA 組顯著增加，見圖13。

圖 13 菲律賓菌素染色的對照組（A）、OA 組（B）及 OA +LDL-C 組（C）HL-7702 細胞內(nèi)膽固醇的熒光顯微鏡觀察（× 400）Fig.13 Fluorescent microscopy of cholesterol contents in HL-7702 cells in CON（A），OA（B）and OA+LDL-C（C）groups with Filipin staining（× 400）

2.2.4 Western blot 分析 結(jié)果顯示，OA + LDL-C組較對照組及OA 組n-SREBP-2 蛋白表達水平均顯著升高（t 分別為-11.307 和-6.420，P 均 ＜ 0.05）；OA + LDL-C 組較對照組及OA 組HMGCR 蛋白表達水平均顯著升高（t 分別為-2.649 和-3.074，P均 ＜0.05）。見圖14 和圖15。與對照組比較，OA組及OA + LDL-C 組LDLR 蛋白表達水平均顯著降低（t 分別為 12.319 和 18.797，P 均 ＜ 0.05），見圖 16 和圖 17。

圖 14 各組 HL-7702 細胞內(nèi) n-SREBP-2、HMGCR 蛋白表達水平的Western blot 檢測Fig.14 Western blotting of expression levels of n-SREBP-2 and HMGCR in HL-7702 cells of various groups

圖 15 各組 HL-7702 細胞內(nèi) n-SREBP-2（A）及 HMGCR（B）蛋白的表達水平Fig.15 Expression levels of n-SREBP-2（A）and HMGCR（B）in HL-7702 cells of various groups

圖 16 各組HL-7702 細胞內(nèi) LDLR 蛋白表達水平的Western blot 檢測Fig.16 Western blotting of expression level of LDLR in HL-7702 cells of various groups

圖17 各組HL-7702 細胞內(nèi)LDLR 蛋白的表達水平Fig.17 Expression levels of LDLR in HL-7702 cells of various groups

3 討 論

NAFLD 是全球常見的慢性代謝性臨床綜合征，為肝硬化及肝癌等終末期肝病的重要病因，且還顯著增加2 型糖尿病、動脈粥樣硬化及結(jié)直腸腫瘤的發(fā)病風險，成為日益嚴峻的公共健康問題［13］。目前，我國NAFLD 患者占全國各類肝病患者的49.3%，NAFLD 已超過慢性乙型肝炎成為第一大肝病。NALFD 疾病譜分為單純性脂肪肝（Nonalcoholic simple fatty liver，NASFL）、NASH、脂肪性肝纖維化及肝硬化等［14］。NASFL 進展緩慢，而 NASH 可進展為肝硬化甚至肝癌、導致2 型糖尿病及心血管疾病的風險顯著增大［15-16］。

研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇代謝與NASH 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［17］。在NASH 進展中，膽固醇在肝細胞內(nèi)的堆積較TG 更具有細胞毒性［18-19］，使用他汀類藥物能有效改善肝脂肪變性、炎癥及纖維化［20］。2019 版《歐洲血脂管理指南》明確指出“壞膽固醇”即LDL-C 越低越好，并將其絕對值降至 ＜ 1.4 mmol ／ L（＜55 mg ／dL）［2018 版 ＜ 1.8 mmol／L（＜ 70 mg ／dL）］［21］。MALHOTRA 等［6］發(fā)現(xiàn)，腸道 SREBP-2 的過度激活能促進飲食誘導NASH 的發(fā)生；MIN 等［12］發(fā)現(xiàn)，NASH 患者體內(nèi) SREBP-2 成熟，HMGCR 表達增加，LDLR 表達減少。本實驗驗證了高脂高膽固醇飲食較單一高脂飲食更能成功誘導動物及細胞NASH 的發(fā)生，進一步證實膽固醇是NASH 發(fā)生發(fā)展的危險因素。在膽固醇誘導NASH 發(fā)生發(fā)展的動態(tài)過程中發(fā)現(xiàn)，高脂高膽固醇組的LDLR 蛋白表達水平先升高后降低，表明膽固醇早期能誘導肝臟高表達LDLR來處理和平衡血液中升高的膽固醇水平，但當細胞內(nèi)的膽固醇含量升高至一定程度后抑制LDLR 的表達，這可能與膽固醇攝入過多引起的細胞膜破壞有關(guān)，也可能與LDLR 在溶酶體中破壞增多導致其向細胞膜的循環(huán)利用減少有關(guān)，具體機制有待進一步研究。模型早期所有高脂組較CON 組n-SREBP-2蛋白表達水平一直處于較低水平，是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過量的膽固醇堆積抑制了固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白（SCAP-SREBP-2）復合物與包被蛋白2 的結(jié)合及轉(zhuǎn)運，從而抑制了SREBP-2 的水解激活［22］；第 8 周末，HFC5 組較 CON 組 HMGCR 的蛋白表達水平降低（P ＜0.05），這表明外源性膽固醇攝入過多抑制HMGCR 調(diào)控的內(nèi)源性膽固醇的合成；造模后期，HFC0、HFC2、HFC5 組較 CON 組 n-SREBP-2 蛋白表達量均增加（P 均＜0.05），在細胞水平也發(fā)現(xiàn)，OA + LDL-C 組較對照組、OA 組 n-SREBP-2、HMGCR蛋白表達水平顯著升高（P ＜0.05），表明在NASH發(fā)生發(fā)展后期，n-SREBP-2、HMGCR 介導的內(nèi)源性膽固醇合成增多并參與了NASH 的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，飲食中的膽固醇能誘導肝臟高表達低密度脂蛋白受體從而進入肝細胞內(nèi)，肝細胞內(nèi)外源性膽固醇的堆積在早期也會對自身內(nèi)源性膽固醇的合成起抑制作用，肝臟的這種自我調(diào)節(jié)機制在高脂高膽固醇飲食的早期能維持肝內(nèi)膽固醇濃度的動態(tài)平衡，從而保護肝臟膽固醇穩(wěn)態(tài)不受破壞；隨著肝內(nèi)膽固醇含量的進一步增加，肝細胞LDLR 表達減少，此時由LDLR 介導的膽固醇攝入減少使肝內(nèi)膽固醇相對不足，這將作為一個肝內(nèi)膽固醇含量降低的信號，反饋性調(diào)節(jié)n-SREBP-2 及HMGCR表達升高，從而打破肝臟膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)，加劇了NASH 的發(fā)生發(fā)展。