毛群穎，高帆，賀鵬飛，梁爭論，徐苗

中國食品藥品檢定研究院，北京102629

2020 年10 月23 日，《世界衛(wèi)生組織腸道病毒71 型滅活疫苗的質(zhì)量、安全性及有效性指導(dǎo)原則》（以下簡稱指導(dǎo)原則）經(jīng)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會（Expert Committeeon Biological Standardization，ECBS）審議通過。該指導(dǎo)原則的通過對全球重癥手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）疫情的防控及我國腸道病毒 71 型（enterovirus 71，EV71）疫苗申請世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）預(yù)認(rèn)證，進(jìn)入聯(lián)合國疫苗采購清單，促進(jìn)我國EV71疫苗走進(jìn)國際市場至關(guān)重要。同時也是我國成為WHO 生物制品標(biāo)準(zhǔn)化和評價(jià)合作中心以來，對WHO 疫苗標(biāo)準(zhǔn)制訂方面的重要貢獻(xiàn)。簡要介紹該指導(dǎo)性文件的制訂背景和主要內(nèi)容對我國更多參與國際標(biāo)準(zhǔn)制訂、更好理解和應(yīng)用該指導(dǎo)原則，提升我國疫苗研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)控理念，促進(jìn)疫苗國際化具有重要意義。因此，本文針對該指導(dǎo)原則的起草背景、中國的技術(shù)支撐及重點(diǎn)內(nèi)容作一介紹。

EV71 滅活疫苗的質(zhì)量、安全性及有效性指導(dǎo)原則是WHO 為確保EV71 疫苗的質(zhì)量及安全、有效而制訂的，旨在為全球監(jiān)管機(jī)構(gòu)及疫苗生產(chǎn)企業(yè)提供的關(guān)于EV71 滅活疫苗生產(chǎn)過程、質(zhì)量控制、非臨床評價(jià)和臨床評價(jià)的指導(dǎo)性文件。為促進(jìn)全球重癥HFMD 的防控和EV71 疫苗的研發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用，2020年WHO 在第72 屆ECBS 會上審議通過了第一部WHO EV71 滅活疫苗質(zhì)量、安全性及有效性指導(dǎo)原則。該指導(dǎo)原則的制訂是由WHO 組織來自全球?qū)W術(shù)界、國家監(jiān)管當(dāng)局、國家控制實(shí)驗(yàn)室及疫苗研發(fā)與生產(chǎn)企業(yè)的相關(guān)專家，根據(jù)中國已獲批上市的3 種EV71 疫苗、候選 EV71 疫苗［1-9］及其他滅活病毒疫苗［如滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗（inactivated poliomyelitis vaccine，IPV）］與甲型肝炎疫苗［10-11］的經(jīng)驗(yàn)提出。

由于目前重組類及其他類型的EV71 疫苗或EV71-CA16 二價(jià)疫苗等均處于研發(fā)早期階段，該指導(dǎo)原則僅適用于以哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)、采用甲醛或其他化學(xué)滅活劑制備的EV71 全病毒滅活疫苗。同時應(yīng)結(jié)合現(xiàn)行WHO 關(guān)于疫苗非臨床評價(jià)［12］、臨床評價(jià)［13］、生物制品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）［14］、細(xì)胞庫［15］、疫苗佐劑和含佐劑疫苗的非臨床評價(jià)［16］及批簽發(fā)［17］等指導(dǎo)原則。

1 起草背景

EV71 除可引起輕癥HFMD 外，還可導(dǎo)致患兒出現(xiàn)腦干腦炎、無菌性腦膜炎、急性脊髓炎、急性小腦共濟(jì)失調(diào)、神經(jīng)源性肺水腫和心肺衰竭等重癥疾病，是導(dǎo)致我國乃至全球重癥HFMD 的主要病原體。重癥患兒具有起病急、病程進(jìn)展迅速、病死率高、可導(dǎo)致認(rèn)知障礙等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的特點(diǎn)［18］。自1969 年首個EV71 在美國成功分離以來［19］，全球均有流行或暴發(fā)報(bào)道［20-25］。1998 年，中國臺灣地區(qū)暴發(fā)EV71 流行，共有405 例重癥病例入院治療，死亡 78 例［26］。中國大陸自 2008 — 2015 年，共報(bào)道1 381 萬例報(bào)告病例，死亡3 342 例，占中國大陸丙類傳染病總死亡人數(shù)的90.3%［27］。另外，馬來西亞、新加坡、緬甸、日本、和越南等國家均有重癥病例和死亡病例的報(bào)道［21-25］。EV71 感染在亞太地區(qū)呈發(fā)病率高、流行范圍廣、重癥和病死人數(shù)增多的流行特征。除亞太地區(qū)外，EV71 引發(fā)的HFMD 在非洲、歐洲和美洲等地區(qū)也有散發(fā)或小規(guī)模暴發(fā)流行。美國、英國、加拿大、新西蘭、挪威等國家均有HFMD 流行的報(bào)道，其中美國和英國出現(xiàn)了重癥和死亡病例［28］。EV71 已成為后脊髓灰質(zhì)炎時代最嚴(yán)重的噬神經(jīng)系統(tǒng)腸道病毒。

EV71 滅活疫苗是我國自主研制的、全球唯一可預(yù)防EV71 重癥HFMD 的新型疫苗［29］。該疫苗是采用病毒培養(yǎng)、純化、滅活和佐劑吸附工藝生產(chǎn)的全病毒滅活疫苗，經(jīng)3 萬余名嬰幼兒臨床試驗(yàn)證實(shí)，疫苗保護(hù)效果均達(dá)90%以上，且安全性良好［1-3］。2015年12 月，分別由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所、北京科興生物制品有限公司和武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)的3 個滅活疫苗產(chǎn)品先后在我國獲批上市。目前已對我國31 省、直轄市和自治區(qū)的4 000 余萬名嬰幼兒接種使用，我國HFMD 死亡人數(shù)顯著下降，至2018 及2019 年已較疫苗上市前的平均死亡人數(shù)下降了92.7%和95.8%［27］，有效控制了我國的EV71 疫情。

在該背景下，中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）專家和WHO 專家充分溝通，建議WHO 制訂 EV71 疫苗指導(dǎo)原則，對促進(jìn)全球EV71 疫苗研發(fā)、生產(chǎn)、應(yīng)用及評價(jià)，確保全球受EV71 威脅的嬰幼兒可獲得安全、有效的疫苗進(jìn)行防護(hù)具有重要意義。

2 中國EV71 疫苗質(zhì)量研究對WHO 指導(dǎo)原則制訂的技術(shù)支撐作用

2.1 中國EV71 疫苗質(zhì)控平臺的建立 EV71 疫苗是在中國國家重大專項(xiàng)重點(diǎn)支撐下，集產(chǎn)、學(xué)、研、檢為一體集成研發(fā)創(chuàng)建的具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新型疫苗。為確保疫苗研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)控水平，中檢院在疫苗研發(fā)早期即開展了EV71 疫苗流行病學(xué)、免疫原性、動物模型建立及交叉保護(hù)等研究，揭示了EV71 血清流行病學(xué)特性、EV71 疫苗免疫原性和交叉保護(hù)效果，為該疫苗研發(fā)和評價(jià)奠定了基礎(chǔ)［30-36］。同時，為創(chuàng)建EV71 疫苗質(zhì)控體系，有效確保EV71疫苗安全、有效和質(zhì)量可控，與國內(nèi)同行開展EV71中和抗體檢測方法學(xué)［37］，建立了EV71 疫苗國家中和抗體標(biāo)準(zhǔn)品［38］、EV71 疫苗標(biāo)準(zhǔn)檢測毒株［39］、EV71疫苗國家抗原標(biāo)準(zhǔn)品［38］、EV71 疫苗國家效力參考品［40］及中和抗體標(biāo)準(zhǔn)化檢測程序，建立了標(biāo)準(zhǔn)化中和抗體檢測平臺及臨床免疫原性評價(jià)平臺，有力支持我國3 家疫苗產(chǎn)品的臨床保護(hù)效果評價(jià)，推動我國EV71 疫苗的獲批上市［29］。

2.2 國際EV71 標(biāo)準(zhǔn)品的建立 為促進(jìn)全球EV71疫情防控及我國獨(dú)創(chuàng)疫苗走入國際市場。2012 年，應(yīng)中檢院邀請，WHO 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制資深單位英國國家生物制品檢定所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）專程來華就我國的EV71 疫苗研發(fā)和質(zhì)量控制研究首次進(jìn)行了深入溝通交流，并得到NIBSC 高度認(rèn)可，于當(dāng)年即向WHO遞交了合作開展EV71 國際標(biāo)準(zhǔn)品研制的申請并獲批。2013 年，中檢院與NIBSC 正式簽署了EV71 國際標(biāo)準(zhǔn)研制合作意向書，開啟了EV71 疫苗國際標(biāo)準(zhǔn)的研究歷程。隨后，在雙方科學(xué)家的共同努力下，針對國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其他關(guān)鍵問題，收集全球9 個基因亞型的EV71，建立了多基因型EV71 病毒庫；采用具有高中和活性和廣譜交叉能力的單抗，建立EV71國際通用抗原檢測試劑，先后解決了EV71 中和抗體交叉保護(hù)、EV71 抗原特性評價(jià)及候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)篩選等關(guān)鍵問題，完成了候選標(biāo)準(zhǔn)品的制備，最終經(jīng)國際協(xié)作標(biāo)定證實(shí)候選標(biāo)準(zhǔn)品可顯著降低實(shí)驗(yàn)室檢測誤差，有效保證EV71 疫苗質(zhì)控、評價(jià)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和可比性。2015 和2019 年成功研制了第1 代EV71 中和抗體國際標(biāo)準(zhǔn)品（14 ／ 140）、第 1 代 EV71中和抗體國際參考品（13 ／ 238）［41-43］、第 1 代 EV71疫苗國際標(biāo)準(zhǔn)品（18 ／ 116）、第 1 代 C4 型和 B4 型EV71 疫苗國際參考品（18 ／ 120 和 18 ／ 156）［44-45］，上述相關(guān)研究不但填補(bǔ)了EV71 國際標(biāo)準(zhǔn)研制的空白，且開創(chuàng)了我國主導(dǎo)研制國際生物制品標(biāo)準(zhǔn)品的先河。同時，系列國際標(biāo)準(zhǔn)品和參考品的建立，也為WHO 指導(dǎo)原則的制訂奠定了基礎(chǔ)。

2.3 中國質(zhì)量控制和評價(jià)技術(shù)要點(diǎn)的發(fā)布 為促進(jìn)WHO 指導(dǎo)原則的制訂，2016 年中檢院組織制訂和發(fā)布了我國首部《EV71 疫苗質(zhì)量控制和評價(jià)技術(shù)要點(diǎn)》［46］。在該技術(shù)要點(diǎn)中重點(diǎn)關(guān)注EV71 疫苗生產(chǎn)的質(zhì)控和評價(jià)，強(qiáng)調(diào)生產(chǎn)全過程的一致性，明確標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和趨勢分析，提出了風(fēng)險(xiǎn)前置等質(zhì)控理念。該技術(shù)要點(diǎn)的頒布不但進(jìn)一步規(guī)范了我國EV71 疫苗的生產(chǎn)和質(zhì)控，確保我國上市疫苗的質(zhì)量安全穩(wěn)定、可靠，同時也為WHO 指導(dǎo)原則的制訂提供了初稿，有力推動了WHO 指導(dǎo)原則的制訂。

3 WHO EV71 疫苗指導(dǎo)原則的制訂

2016 年我國首次在WHO ECBS 會議上提出了制訂EV71 滅活疫苗的質(zhì)量、安全性及有效性指導(dǎo)原則的建議。并于2017 和2018 年，先后組織召開了中日韓第三屆疫苗研究及質(zhì)量控制研討會和第四屆WHO 疫苗標(biāo)準(zhǔn)化和監(jiān)管評價(jià)合作中心國際會議，利用這兩個國際會議平臺，將《EV71 疫苗質(zhì)量控制和評價(jià)技術(shù)要點(diǎn)》提請國際專家討論，并初步探討EV71 滅活疫苗WHO 指導(dǎo)原則的框架和主體內(nèi)容。通過與WHO 及國際專家的多次溝通討論，最終推動WHO 于2019 年在我國上海召開了“腸道病毒71 型（EV71）滅活疫苗的質(zhì)量、安全性及有效性指導(dǎo)原則制訂工作會議”，會議確立了指導(dǎo)原則的編寫原則和方案，成立由我國包括王軍志院士等7 名國際權(quán)威專家構(gòu)成的指南起草專家組，正式啟動該指導(dǎo)原則的編寫和制訂工作。在起草專家組及國內(nèi)外業(yè)內(nèi)專家的共同努力下，2020 年4 月該指導(dǎo)原則的編寫工作順利完成。經(jīng)1 個月公開征求意見，2020 年7 月在綜合全球?qū)＜乙庖姾徒ㄗh的基礎(chǔ)上，形成了最終版并遞交 ECBS 審評（WHO ／ BS2020.2388）［47］。2020 年 10 月 19 — 23 日，由包括 ECBS 專家委員、顧問、國際組織代表及WHO 專家和各國監(jiān)管部門代表等100 余位專家，對該指導(dǎo)原則再次進(jìn)行了逐條討論后，第一部《世界衛(wèi)生組織腸道病毒71 型滅活疫苗的質(zhì)量、安全性及有效性指導(dǎo)原則》順利通過第72 屆WHO ECBS 會議審議，為確保全球EV71 疫苗的質(zhì)量、安全和有效性提供了指導(dǎo)原則。

4 WHO EV71 疫苗指導(dǎo)原則的要點(diǎn)簡介

該指導(dǎo)原則主要包括EV71 疫苗的生產(chǎn)制造、非臨床評價(jià)、臨床評價(jià)及對國家監(jiān)管機(jī)構(gòu)（National Regulatory Authorities，NRAs）的指導(dǎo)建議 4 個部分。以下對指導(dǎo)原則的主要內(nèi)容和制訂過程中專家關(guān)注和討論的焦點(diǎn)問題作一介紹。

4.1 生產(chǎn)制造 本部分主要介紹了從細(xì)胞庫和種子批到EV71 疫苗培養(yǎng)、純化、滅活及配置的全過程和質(zhì)量控制，其中著重關(guān)注安全性和有效性。

4.1.1 病毒滅活 為確保疫苗安全性，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立良好的純化、滅活程序，以確保病毒完全滅活且無殘留傳染性，并進(jìn)行充分驗(yàn)證，保證疫苗安全性。根據(jù)IPV 生產(chǎn)工藝經(jīng)驗(yàn)建議采用純化、過濾和滅活順序，并對病毒滅活前、滅活中和滅活驗(yàn)證均提出了詳細(xì)要求。

4.1.1.1 病毒滅活前 應(yīng)進(jìn)行病毒滴度、抗原含量、比活等檢測；應(yīng)采用0.22 μm 濾膜進(jìn)行過濾，以去除顆粒物和其他干擾物質(zhì)，并在過濾后24 h 內(nèi)開始病毒滅活，中間間隔時間最長不超過72 h。應(yīng)保留病毒過濾后滅活前的樣本，進(jìn)行病毒滴度檢測，以監(jiān)測病毒滅活動力曲線。

4.1.1.2 病毒滅活 滅活方法應(yīng)證明可持續(xù)滅活EV71，且不破壞病毒抗原活性和免疫原性。滅活過程應(yīng)監(jiān)測病毒滴度，滅活周期通常應(yīng)大于使病毒滴度降至檢測不到時間的2 倍。滅活過程中應(yīng)進(jìn)行第2 次過濾。滅活動力曲線應(yīng)至少4 個時間點(diǎn)，以顯示活病毒濃度隨時間的降低情況。應(yīng)測定滅活前、滅活中和滅活結(jié)束時每一個滅活容器的病毒滴度和抗原含量。應(yīng)至少對5 個連續(xù)批次病毒進(jìn)行滅活效果和動力學(xué)的一致性監(jiān)測。

4.1.1.3 滅活驗(yàn)證 取樣量應(yīng)不少于總體積的5%或1 000 劑成品，并接種敏感細(xì)胞。接種病毒的稀釋度應(yīng)不大于1 ／ 4，每毫升樣品應(yīng)接種不少于3 cm2細(xì)胞。如采用甲醛作為滅活劑，則樣品應(yīng)采用亞硫酸氫鹽中和，透析后檢測。樣品培養(yǎng)時間應(yīng)不少于21 d，期間至少進(jìn)行2 次細(xì)胞傳代。在滅活驗(yàn)證同時或結(jié)束時，應(yīng)接種陽性對照（少量的活病毒），以保證檢測方法的靈敏度。在接種后5 ～7 d 內(nèi)應(yīng)及早更換培養(yǎng)液，以保證培養(yǎng)液處于良好狀態(tài)。

4.1.2 質(zhì)量控制 為確保有效性，提出效力試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行體內(nèi)、體外效力（抗原含量）兩方面檢測。在抗原含量檢測中應(yīng)采用經(jīng)驗(yàn)證的免疫化學(xué)方法，并采用經(jīng)第1 代EV71 疫苗國際標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)品檢測。一旦獲得連續(xù)足夠批次的數(shù)據(jù)證實(shí)生產(chǎn)一致性，且證實(shí)體內(nèi)外效力標(biāo)準(zhǔn)具有可比性，則體內(nèi)效力可省略。如疫苗含有佐劑，應(yīng)解吸附后再進(jìn)行檢測。如疫苗中含有其他抗原，則應(yīng)證明EV71 抗原檢測方法的適用性。如EV71 抗原檢測方法不適用，則應(yīng)采用體內(nèi)效力法進(jìn)行。

4.2 非臨床評價(jià) 包括產(chǎn)品特性工藝開發(fā)、免疫原性、動物保護(hù)及安全性4 個部分。其中著重強(qiáng)調(diào)交叉保護(hù)，建議在動物模型中進(jìn)行交叉攻毒保護(hù)研究，以評估對不同基因型或異源病毒的保護(hù)力，證明疫苗保護(hù)的廣度。

4.3 臨床評價(jià) 由于目前研究已獲得充分?jǐn)?shù)據(jù)證明EV71 滅活疫苗的保護(hù)效果，因此在臨床評價(jià)中同樣對交叉保護(hù)提出了重點(diǎn)關(guān)注，包括疫苗免疫個體對不同基因型、不同毒株的交叉能力及對流行病毒的進(jìn)化、變異進(jìn)行監(jiān)測，如果疫苗上市國家出現(xiàn)新的亞種群病毒，需要對潛在的交叉保護(hù)能力進(jìn)行深入的臨床調(diào)查。

4.3.1 實(shí)驗(yàn)室檢測 包括血清學(xué)檢測和病原檢測，基于目前已建立良好的EV71 中和抗體檢測方法，在血清學(xué)檢測中鼓勵開發(fā)高通量檢測方法，同時檢測應(yīng)采用第1 代EV71 中和抗體國際標(biāo)準(zhǔn)品和國際參考品。在病原檢測中提出由于多種病原可導(dǎo)致HFMD，應(yīng)采用特異性良好的方法確認(rèn)病原。

4.3.2 免疫原性 免疫劑量和免疫程序的確立應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注免疫前抗體陰性人群，探索獲得良好免疫應(yīng)答的最小劑量和最短間隔周期。應(yīng)該關(guān)注交叉保護(hù)，建議使用系列臨床分離株進(jìn)行研究，并關(guān)注自然感染者。

4.3.3 有效性評價(jià) 應(yīng)在臨床上證明對EV71 所致HFMD 和皰疹性咽峽炎具有明確的保護(hù)作用方可獲批上市。疾病的定義建議為一種發(fā)熱伴有口腔黏膜、手、腳或臀部的丘疹或水泡疹的疾病。嚴(yán)重病例的定義應(yīng)參照WHO 所述的神經(jīng)、呼吸或循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)并發(fā)癥。EV71 感染的實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)建議當(dāng)滿足以下一點(diǎn)可確認(rèn)為EV71 感染：①膀胱 ／ 咽拭子或糞便中EV71 RNA 的檢測陽性；②病毒分離與VP1序列分析證明為EV71；③EV71 IgM 陽性。

4.4 對各國NRAs 的建議 與其他疫苗相近，提出對于一個新產(chǎn)品批準(zhǔn)上市，制造商應(yīng)充分證明新產(chǎn)品的質(zhì)量一致性；并對生產(chǎn)、質(zhì)控及可能影響EV71 滅活疫苗質(zhì)量、安全性或有效性的任何重大變更，均應(yīng)與NRAs 討論并獲得NRAs 的批準(zhǔn)；為保證質(zhì)量一致性，應(yīng)采用國際標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定國家或工作參考物質(zhì)等要求。

5 小 結(jié)

WHO EV71 疫苗指導(dǎo)原則是為確保EV71 疫苗的質(zhì)量安全有效，為全球監(jiān)管機(jī)構(gòu)及疫苗生產(chǎn)企業(yè)提供關(guān)于EV71 滅活疫苗生產(chǎn)過程、質(zhì)量控制、非臨床評價(jià)和臨床評價(jià)的指導(dǎo)性文件。該指導(dǎo)原則是在我國的大力推動下，在完成兩個國際標(biāo)準(zhǔn)品研制的基礎(chǔ)上，主導(dǎo)建立的首個EV71 疫苗國際文字標(biāo)準(zhǔn)。在指導(dǎo)原則制定過程中，國際專家充分尊重國內(nèi)疫苗研發(fā)和審評審批的成功經(jīng)驗(yàn)，同時，融入國際上IPV 和甲肝疫苗等同類疫苗國際標(biāo)準(zhǔn)的先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)和國際要求，我國監(jiān)管和研發(fā)專家通過深度參與國際標(biāo)準(zhǔn)的制定，對疫苗國際指南的制定原則有了更深入的了解和把握，對今后疫苗研發(fā)也有很多借鑒意義。該指導(dǎo)原則的制訂不僅為全球EV71 疫苗的研發(fā)、生產(chǎn)、評價(jià)及應(yīng)用提供了基本原則，為促進(jìn)全球EV71疫情防控提供了關(guān)鍵指南，同時還可有力推動我國獨(dú)創(chuàng)疫苗走入國際市場，顯著提升了我國生物制品的國際影響力，開創(chuàng)了我國疫苗國家標(biāo)準(zhǔn)向國際標(biāo)準(zhǔn)的升級。

志謝感謝中國食品藥品檢定研究院的王軍志院士和王佑春首席對本研究的特別貢獻(xiàn)