趙欣，楊丹，金蘇

國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京100022

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）于 2019 年 12 月初在我國被發(fā)現(xiàn)，呈現(xiàn)出高傳染性及快速傳播的特點，并可導致一定比例患者出現(xiàn)重癥新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）。SARS-CoV-2 是一種與重癥急性呼吸道綜合癥冠狀病毒（SARS-CoV）關系密切的新型人類冠狀病毒［1-2］，已在世界范圍內(nèi)傳播并引發(fā)了全球性公共衛(wèi)生危機。SARS-CoV-2 引起的臨床表現(xiàn)包括無癥狀感染、輕度流感樣癥狀、肺炎、嚴重急性呼吸窘迫綜合征甚至死亡［3-4］。COVID-19 是一種新型人類疾病，尚無有效的治療方法，且SARSCoV-2 的保護性免疫程序目前仍尚不清楚，存在康復患者再次感染的可能性［5-7］。因此，研制安全有效的COVID-19 疫苗是防治SARS-CoV-2 的有效手段之一。

自COVID-19 疫情發(fā)生以來，我國疫苗研發(fā)及生產(chǎn)企業(yè)總體上采用滅活疫苗、重組蛋白疫苗、載體疫苗、減毒活疫苗、核酸疫苗共5 條技術路線進行疫苗研發(fā)。mRNA 疫苗作為核酸類疫苗，憑借其自身特點，國內(nèi)外多家企業(yè)正積極進行研發(fā)及申報。本文結(jié)合近年來國內(nèi)外mRNA 疫苗的發(fā)展趨勢及申報現(xiàn)狀，對SARS-CoV-2 mRNA 疫苗的技術特點進行分析，結(jié)合審評實踐，著重就臨床前藥學研發(fā)和評價的一般考慮及評價要點展開探討，以期促進此類藥物由研發(fā)順利轉(zhuǎn)入早期臨床試驗階段，并加強藥物研發(fā)的風險控制。

1 mRNA 疫苗的概述

Jacob 和 Monod 在 1961 年提出 mRNA 的概念，1990 年 WOLFF 等［8］證明，將體外轉(zhuǎn)錄（in vitro transcribed IVT）mRNA 或質(zhì)粒DNA 直接注射至小鼠骨骼肌，可在注射的肌肉中表達其編碼蛋白。1995 年CONRY 等［9］首次將mRNA 作為疫苗進行免疫測試。20 世紀90 年代，進行了mRNA 疫苗多種臨床前應用探索，包括癌癥mRNA 疫苗、傳染病mRNA 疫苗等［10-14］。隨著RNA 生物學、化學、穩(wěn)定性和遞送系統(tǒng)方面的技術進步，克服了直接人體注射mRNA 免疫效果差、半衰期短的一系列障礙，加速了mRNA疫苗的發(fā)展［15-16］。

核酸疫苗包括 DNA 疫苗和 mRNA 疫苗［15］，mRNA 疫苗與其他核酸疫苗理論上的主要區(qū)別包括：mRNA 一旦到達細胞質(zhì)就會立即翻譯，不需進入細胞核即可發(fā)揮功能；mRNA 不會整合至基因組中，不會造成插入突變的風險；多數(shù)藥物應用表明，mRNA 疫苗中mRNA 瞬時表達僅有短暫活性，通過人體的自然機制代謝和消除，因此被認為是安全的；mRNA 的生產(chǎn)相對簡單、成本較低［16-17］。

2 mRNA 疫苗的研發(fā)進展

陽離子聚合物和脂類具有將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)運進入細胞的能力，將其制成納米顆粒轉(zhuǎn)運mRNA，并進行了廣泛的研究，結(jié)果表明，納米顆粒載體具有能穿過生物屏障、提高生物相容性和延長循環(huán)時間等優(yōu)點，能有效地將核酸傳遞至靶細胞，提高了核酸類藥物疾病治療的成功率，加速了mRNA 疫苗的發(fā)展。納米顆粒載體對mRNA 藥物的轉(zhuǎn)運效率很大程度上取決于其逃逸溶酶體的能力，即納米顆粒載體進入細胞后，經(jīng)膜泡包被并傳遞進入溶酶體，保護包裹mRNA 免受溶酶體降解及破壞，從溶酶體成功逃離至細胞質(zhì)發(fā)揮藥效［18-19］。

香港大學袁國勇團隊報告了COVID-19 康復患者發(fā)生再次感染的第1 例病例，研究表明，盡管由于自然感染或接種疫苗產(chǎn)生了群體免疫力，但SARSCoV-2 可能持續(xù)在人群中傳播。對再次感染患者的進一步研究將闡明對SARS-CoV-2 免疫保護的重要因素，對疫苗的設計、研發(fā)具有重要意義［6］。

綜上所述，mRNA 疫苗人體免疫的過程一定程度上模仿了病毒入侵過程，能激發(fā)人體細胞免疫和體液免疫反應。對于mRNA 疫苗的開發(fā)及質(zhì)量研究，在滿足常規(guī)納米制劑藥物的關鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Attribute，CQA）前提下，還應重點關注以下質(zhì)量研究的相關方面：制劑電荷（Zeta 電位）不僅影響納米顆粒的穩(wěn)定性，還會影響納米制劑的入胞、內(nèi)體逃逸以及不良反應；mRNA 疫苗在生產(chǎn)過程中、終產(chǎn)品、穩(wěn)定性研究等不同階段納米顆粒粒徑分布的變化；制劑中陽離子聚合物及脂質(zhì)成分的選擇是為包裹mRNA 以達到相應藥效，因此制劑的pH、脂質(zhì)成分的化學結(jié)構、mRNA 包封率等，均會影響制劑成分與mRNA 復合形成納米顆粒的穩(wěn)定性、體內(nèi)藥物釋放、藥效等；mRNA 納米顆粒在體內(nèi)外表達及免疫原性相關研究，是非臨床質(zhì)量研究中對藥物有效性、安全性研究的重要技術支持。上述藥品CQA 不僅是mRNA 疫苗在人體內(nèi)發(fā)揮作用機制的關鍵影響因素，也是藥品研發(fā)及質(zhì)量研究的關注點。

在COVID-19 疫情爆發(fā)以前，mRNA 疫苗已在預防性疫苗和治療性腫瘤疫苗領域開展了多個臨床研究，其中進展最快的尚在Ⅱ期臨床試驗階段［20-23］。

自COVID-19 疫情發(fā)生以來，國內(nèi)外多家企業(yè)正積極研發(fā)、申報SARS-CoV-2 mRNA 疫苗。國外已有兩家企業(yè)對SARS-CoV-2 mRNA 疫苗的臨床試驗情況進行了相關報道。Moderna 公司候選疫苗mRNA-1273，采用脂質(zhì)納米顆粒包裹經(jīng)核酸修飾的SARSCoV-2 Spike 糖蛋白，Ⅰ期臨床試驗顯示，間隔28 d 2 次免疫后，抗體隨接種劑量及次數(shù)增高，不良事件包括疲勞、寒戰(zhàn)、頭痛、肌痛和注射部位疼痛［24］；BioNtech 公司候選疫苗BNT162b1，采用脂質(zhì)納米顆粒包裹SARS-CoV-2 三聚化Spike 糖蛋白受體結(jié)合區(qū)域（receptor-binding domain，RBD），Ⅰ／ Ⅱ期臨床中期試驗顯示，間隔21 d 2 次免疫后，血清中RBD 結(jié)合IgG 濃度和SARS-CoV-2 綜合抗體滴度隨接種劑量及次數(shù)增高，幾何平均綜合效價達到COVID-19 恢復期人血清的1.8 ～2.8 倍，局部及全身不良反應呈劑量依賴性，一般是輕度到中度，并且是短暫的［17］。

國內(nèi)軍科院聯(lián)合蘇州艾博公司申報的SARSCoV-2 mRNA 疫苗ARCov 已獲批進入臨床試驗，目前尚無相關臨床試驗數(shù)據(jù)的報道。臨床前研究表明，候選疫苗ARCoV 采用脂質(zhì)納米顆粒包裹SARSCoV-2 RBD，經(jīng)肌肉免疫小鼠和非人靈長類動物，可誘導SARS-CoV-2 中和抗體及偏向Th1 的細胞免疫反應。在小鼠中接種2 劑ARCoV 可完全保護小鼠免受SARS-CoV-2 小鼠適應株病毒的攻擊。ARCoV以液體配方制備，可在室溫下儲存至少1 周，目前正處于一期臨床試驗階段［25］。

3 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗申報臨床藥學研究一般原則及評價思考

SARS-CoV-2 mRNA 疫苗研發(fā)總體工藝路線為選取SARS-CoV-2 蛋白，制備體外轉(zhuǎn)錄mRNA，研發(fā)制劑組成、開發(fā)制劑工藝、以mRNA 原液制備納米顆粒，獲得終產(chǎn)品。

目前全球范圍內(nèi)尚無mRNA 疫苗批準上市，對該類疫苗用于人體的安全性和有效性尚在探索中。同時，mRNA 疫苗創(chuàng)新程度較高，制劑工藝及成分相對復雜，綜合考慮疫苗應用于健康人群，對其質(zhì)量和安全性也提出了較高的要求。對于SARS-CoV-2 mRNA 疫苗的開發(fā)和藥學技術審評，基本理念應滿足疫苗產(chǎn)品的常規(guī)要求，此外，還應結(jié)合本品mRNA分子結(jié)構、制劑處方組成、作用機制的新特點以及不同于以往疫苗的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制等方面，進行相應的研究。下面擬結(jié)合具體藥學評價實踐，對相關技術審評思考進一步闡述。

3.1 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗研發(fā)風險控制相關思考

ICH Q8 提出質(zhì)量源于設計（Quality by Design，QbD）的藥品質(zhì)量管理理念，即藥物開發(fā)的目的是設計出高質(zhì)量的產(chǎn)品，其制造過程始終如一的提供產(chǎn)品預期的性能。從藥物研發(fā)及生產(chǎn)中獲得的對產(chǎn)品的科學認知及理解有助于建立設計空間及產(chǎn)品質(zhì)量控制體系［26］。

SARS-CoV-2 mRNA 疫苗藥學評價以風險控制為核心，研發(fā)企業(yè)應結(jié)合現(xiàn)有科學認知及相關產(chǎn)業(yè)經(jīng)驗，在充分研究的基礎上進行產(chǎn)品設計及工藝開發(fā)，藥學研究應明確潛在的目標質(zhì)量概況（Quality Target Product Profile，QTTP）、CQA、有害雜質(zhì)等，SARS-CoV-2 mRNA 疫苗藥學評價風險控制相關思考如下。

3.1.1 安全性風險方面 可能來源于mRNA、脂質(zhì)納米顆粒（LNP）兩個方面，建議重點關注脂質(zhì)相關毒性。可從非特異性免疫反應、制劑及貯存期間產(chǎn)生的降解產(chǎn)物、陽性聚合物材料本身的安全性、各類雜質(zhì)累積的安全性風險等方面進行綜合考慮。

3.1.2 mRNA 方面 應充分研究mRNA 修飾比例、poly A 加尾效率、加帽效率、去磷酸化程度、mRNA降解片段、mRNA 的完整性及序列的準確性、dsRNA、mRNA 含量等。其中未加帽、磷酸化mRNA、dsRNA具有非特異免疫刺激作用，是免疫學方面重點關注的雜質(zhì)；mRNA 修飾具有兩面性，一方面增加mRNA的穩(wěn)定性，但也會增強mRNA 的非特異性免疫反應；加帽率、poly A 長度、mRNA 完整性將可能影響產(chǎn)物的有效性。mRNA 加帽工藝、加帽結(jié)構、加帽原材料雜質(zhì)、加帽mRNA 體內(nèi)外表達效率、體內(nèi)外免疫原性等方面也是藥學研究關注點。

3.1.3 脂質(zhì)納米顆粒CQA 除常規(guī)納米制劑的CQA 外，還應重點關注：①電荷。zeta 電位不僅影響納米粒的穩(wěn)定性，還會影響納米制劑的入胞、內(nèi)體逃逸及不良反應；②粒徑分布；③pH。制劑中含有陽離子聚合物，pH 會影響材料和mRNA 的復合；④納米顆粒對mRNA 的包封率；⑤包封后mRNA 的完整性、功能性及含量；⑥mRNA 釋放問題。

3.1.4 雜質(zhì)方面 質(zhì)量研究中的雜質(zhì)主要包括工藝相關雜質(zhì)和產(chǎn)品相關雜質(zhì)，對影響安全性的雜質(zhì)應高度重視，對其進行充分研究，包括相關雜質(zhì)的產(chǎn)生／引入、工藝去除、可監(jiān)測程度等。制劑相關雜質(zhì)應重點關注：①聚正電荷材料相關雜質(zhì)，包括材料合成產(chǎn)生的雜質(zhì)及mRNA 復合過程中可能產(chǎn)生的雜質(zhì)；②不飽和脂質(zhì)的氧化及相關降解產(chǎn)物；③納米顆粒聚集產(chǎn)生的顆粒物也是潛在雜質(zhì)，應基于實際情況來評估；④未組裝的脂質(zhì)分子、陽離子物質(zhì)、游離mRNA。未組裝的脂質(zhì)分子會影響LNP 的穩(wěn)定性；游離mRNA 易降解，同時也可能引起非特異免疫刺激，影響產(chǎn)品的安全有效性。

3.2 目標抗原選擇及DNA 模板設計 目的抗原的選擇是mRNA 疫苗開發(fā)的基礎，需對選擇的抗原序列進行較為充分的研究。明確目的抗原選擇的依據(jù)及其表達蛋白在預防SARS-CoV-2 中的作用機理，明確抗原序列載體構建原件結(jié)構，如帽子結(jié)構、5′非翻譯區(qū)（Untranslated region，UTR）、編碼抗原蛋白的開放閱讀框（Open reading frame，ORF）、3′UTR、PolyA尾長度等，提供相應的選擇依據(jù)及相關研究數(shù)據(jù)，需關注目的序列的優(yōu)化、核苷酸的化學修飾、表達效率、免疫原性、二級結(jié)構、穩(wěn)定性等方面。

3.3 mRNA 疫苗遞送系統(tǒng)開發(fā) mRNA 遞送系統(tǒng)的應用保證了mRNA 疫苗的免疫原性，由于使用陽離子聚合物、脂質(zhì)體等相關成分，在一定程度上增加了質(zhì)量控制的難度，因此，mRNA 疫苗遞送系統(tǒng)的開發(fā)為本產(chǎn)品的難點之一。

研發(fā)者應對遞送系統(tǒng)的組成成分、配比等進行篩選研究，提供遞送系統(tǒng)各組分的選擇依據(jù)、來源，對各組分生產(chǎn)工藝、特性鑒定、質(zhì)量控制、穩(wěn)定性、雜質(zhì)等進行質(zhì)量研究，應按照相應法規(guī)和指導原則的要求提供申報資料。

由于國外相關企業(yè)對mRNA 疫苗研發(fā)多年，對相關技術進行了專利申報，研發(fā)企業(yè)應關注相應專利申報情況，避免專利侵權。

3.4 生產(chǎn)工藝及質(zhì)量研究 工藝開發(fā)階段，應進行各步工藝參數(shù)對mRNA 和 ／ 或制劑質(zhì)量特性影響的研究；研發(fā)階段應通過工藝參數(shù)的研究和優(yōu)化，確立mRNA 和／ 或制劑的生產(chǎn)工藝及工藝過程控制策略。

臨床樣品制備工藝應具備一定規(guī)模，并且還應具有一定的生產(chǎn)連續(xù)性和放大可行性，臨床樣品應在符合GMP 的條件下生產(chǎn)。產(chǎn)品開發(fā)進程中應不斷積累數(shù)據(jù)，持續(xù)確認工藝的一致性和可控程度。

mRNA 原液生產(chǎn)工藝應關注生產(chǎn)工藝設置的合理性，對生產(chǎn)工藝開發(fā)及確定提供研究資料，原液生產(chǎn)工藝優(yōu)化應提高產(chǎn)品純度及質(zhì)量。mRNA 原液質(zhì)量研究應關注mRNA 序列完整性、加帽率、去磷酸化、Poly A 尾長度、純度、mRNA 序列生物活性表達、工藝相關雜質(zhì)的去除、產(chǎn)品相關雜質(zhì)殘留等相關方面。

mRNA 疫苗納米顆粒生產(chǎn)工藝設備的選用應考察現(xiàn)有制劑規(guī)模、放大能力、耗材使用次數(shù)、GMP符合情況等。納米顆粒質(zhì)量研究應關注包封率、粒徑分布、納米粒的穩(wěn)定性、純度、不完整LNP、納米顆粒各成分含量、工藝相關雜質(zhì)的去除、免疫原性等相關方面。

3.5 佐劑 鑒于mRNA 遞送系統(tǒng)的復雜性及可能存在的佐劑作用，結(jié)合國內(nèi)外在研mRNA 遞送平臺的實際情況，目前不建議添加單獨的佐劑成分。如果需要添加佐劑，應保證添加的佐劑不會引起不可接受的毒性。臨床前須通過明確的功能指標及試驗研究證實佐劑發(fā)揮的具體的免疫調(diào)節(jié)作用，同時關注添加該佐劑成分后可能引入的風險，如對mRNA結(jié)構、非預期免疫反應及免疫損傷和免疫病理等。使用佐劑所帶來的增強免疫應答的潛在獲益必須超過其所帶來的風險等。應參照佐劑相關研究指南提交全套的佐劑藥學研究資料。

3.6 生物活性檢測 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗為新生事物，納米顆粒制劑組成及制備較為復雜，相應研發(fā)候選疫苗均處于研發(fā)早期，細胞水平表達活性、體內(nèi)效力等綜合質(zhì)控指標較為重要，在研發(fā)過程中需積累相關數(shù)據(jù)。

生物學活性檢測可采用體外或體內(nèi)檢測。研發(fā)早期階段建議根據(jù)質(zhì)量研究部分選擇適宜的方法建立體內(nèi)效力質(zhì)控檢測；必要時，根據(jù)產(chǎn)品的作用機理建立細胞免疫檢測活性的質(zhì)控檢測。由于生物學活性方法存在較大的變異性，建議設立參考疫苗以適宜的比值方法予以擬定標準限度。

3.7 研發(fā)期間的工藝變更 變更是維持產(chǎn)品生產(chǎn)工藝先進性、提高產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效率的重要手段。SARS-CoV-2 mRNA 疫苗在研發(fā)階段，尤其是研發(fā)早期，藥學變更往往不可避免。變更應以持續(xù)提升產(chǎn)品的安全性、有效性和質(zhì)量可控性為原則，對研發(fā)產(chǎn)品進行持續(xù)的質(zhì)量研究和趨勢分析，改進生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)過程控制能力，持續(xù)提升質(zhì)量控制標準，提升中間產(chǎn)品和成品的質(zhì)量控制水平［27-28］。

鼓勵采用臨床試驗樣品的工藝代表性批次開展臨床前藥理毒理研究。如存在臨床前到臨床批次的藥學變更，需提供變更前后詳細的藥學對比信息并對變更后工藝進行詳細描述、分析和風險評估，應提供相應的可比性研究數(shù)據(jù)證明變更未對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。需提前進行可比性研究的設計，對取樣批次、步驟、需要開展的檢測予以提前布局，尤其需關注各個研發(fā)階段的代表性留樣問題。

如質(zhì)量可比性分析研究不足以證實變更未對產(chǎn)品產(chǎn)生不利影響時，可能需要補充非臨床、甚至臨床研究數(shù)據(jù)，如免疫原性比較和必要的安全性比較等。鑒于mRNA 疫苗的復雜性及目前的有限認知，對于臨床期間的重大變更，建議開展變更前后體液免疫、細胞免疫等全面的效力研究的比較分析。

4 結(jié) 語

SARS-CoV-2 自流行以來，我國已采取強有力的防控措施，并較好地控制了COVID-19 在我國的流行，但世界范圍內(nèi)COVID-19 的流行傳播仍未得到有效控制。目前尚無有效治療COVID-19 的方法，疫苗的開發(fā)及應用對于COVID-19 的防治尤為重要。

目前全球范圍內(nèi)尚無mRNA 疫苗批準上市，對該類疫苗用于人體的安全性和有效性尚在探索中。結(jié)合SARS-CoV-2 mRNA 疫苗國內(nèi)外申報情況及相關臨床試驗，對于這種新型疫苗開發(fā)模式，藥學研究應充分考慮其作為“創(chuàng)新藥”的研發(fā)規(guī)律及技術特點，在保證臨床用藥足夠安全、有效和質(zhì)量可控性的前提下，應對其進行充分的風險獲益評估，以評價其是否可進入人體臨床試驗。相信在工業(yè)界創(chuàng)新驅(qū)動、技術研發(fā)不斷積累、對mRNA 疫苗藥學研究不斷深入的情況下，以及與監(jiān)管風險管控的互動推進下，未來將不斷有SARS-CoV-2 mRNA 疫苗獲批進入臨床試驗以驗證其對人體的安全性和有效性。