高 寒，徐 偉*，張宇航，邱智東，傅超美，綦曉娜，賈艾玲, *

? 藥理與臨床 ?

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的刺五加總苷抗疲勞作用機(jī)制研究

高 寒1，徐 偉1*，張宇航1，邱智東1，傅超美2，綦曉娜3，賈艾玲1, 2*

1. 長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥有效成分省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130117 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137 3. 北華大學(xué)附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 吉林 132000

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究刺五加總苷抗疲勞的潛在作用機(jī)制。以刺五加總苷中7種主要活性成分為研究對象，利用Swiss Target Prediction網(wǎng)絡(luò)平臺預(yù)測其作用靶點(diǎn)；通過GeneCards、OMIM、DiGseE數(shù)據(jù)庫獲取與疲勞有關(guān)的靶標(biāo)，借助Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“活性成分-抗疲勞靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并通過度值篩選核心成分；使用String平臺進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，結(jié)合Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，通過度值、節(jié)點(diǎn)緊密度、節(jié)點(diǎn)介度篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，并利用DisGeNET數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)的類型進(jìn)行歸屬；使用AutoDock vina軟件對核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接；采用DAVID數(shù)據(jù)庫對刺五加總苷抗疲勞的作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。獲得刺五加總苷中7種主要活性成分包括刺五加苷A、刺五加苷B、刺五加苷B1、刺五加苷C、刺五加苷D、刺五加苷E和芝麻素，預(yù)測得到抗疲勞靶點(diǎn)83個(gè)，篩選出核心成分3個(gè)，包括刺五加苷B、刺五加苷B1、刺五加苷C，關(guān)鍵靶點(diǎn)4個(gè)，包括熱休克蛋白90α家族A級成員1（heat shock protein 90 α family class A member 1，HSP90AA1）、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）；分子對接結(jié)果顯示，核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能力與三磷酸腺苷二鈉（ATP-2Na）相近；基因富集分析得到GO功能條目250個(gè)（＜0.05），通路36條（＜0.05）；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，刺五加總苷主要通過藥物反應(yīng)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、缺氧反應(yīng)等生物過程，以及調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、胰島素信號通路和物質(zhì)代謝等發(fā)揮抗疲勞作用。初步探究了刺五加總苷抗疲勞作用的潛在靶點(diǎn)和相關(guān)通路，為刺五加抗疲勞作用機(jī)制的研究提供科學(xué)依據(jù)和參考。

刺五加總苷；抗疲勞；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；刺五加苷B；刺五加苷B1；刺五加苷C

疲勞最早記載于《金匱要略》，是一種常見而復(fù)雜的疾病狀態(tài)，隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏加快，由疲勞引發(fā)的慢性疲勞綜合征發(fā)病率逐年上升，給社會(huì)造成了很大負(fù)擔(dān)[1]。世界衛(wèi)生組織提出，疲勞已成為現(xiàn)今社會(huì)危害人類身心健康的主要因素之一，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[2]。研究表明，疲勞的產(chǎn)生可能與免疫系統(tǒng)異常、線粒體/能量代謝異常、心血管系統(tǒng)異常等過程有關(guān)[3-5]。

刺五加為五加科植物刺五加(Rupr. et Maxim.) Harms的干燥根和根莖或莖[6]。刺五加的應(yīng)用歷史悠久，歷代本草著作中均有所記載。南朝陶弘景曾在《名醫(yī)別錄》中指出，刺五加以“五葉者良”，具有“補(bǔ)中、益精、堅(jiān)筋骨、強(qiáng)志意”的功效。明代李時(shí)珍在《本草綱目》中記載“寧得五加一把，不要金玉滿車”，稱刺五加“久服輕身耐老”，被列為上品；刺五加性溫，味辛、微苦，歸脾、腎、心經(jīng)，主治脾腎陽虛、腰膝酸痛、體虛乏力、食欲不振、失眠多夢等癥[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，刺五加在免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、抗腫瘤、抗衰老、抗應(yīng)激等方面均有良好表現(xiàn)[8-11]。其中抗疲勞作用尤為顯著，刺五加總苷是刺五加抗疲勞的主要活性成分，其作用較刺五加根提取物強(qiáng)40～120倍，且強(qiáng)于人參提取物和人參皂苷[12]，但刺五加總苷發(fā)揮抗疲勞作用的分子機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)等學(xué)科，借助計(jì)算機(jī)分析技術(shù)，通過“疾病-表型-基因-藥物”多層次網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，從整體角度探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)而多層次地闡明藥物的作用機(jī)制，體現(xiàn)了中醫(yī)辨證的特點(diǎn)和中藥治療的整體觀，近年來已經(jīng)成為中藥研究的一種有效技術(shù)手段[13-18]。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，基于“藥物-靶點(diǎn)-通路”多層次網(wǎng)絡(luò)模式，預(yù)測刺五加總苷抗疲勞作用的相關(guān)靶點(diǎn)及作用機(jī)制，并利用分子對接技術(shù)對預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行佐證，為刺五加的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 方法

1.1 刺五加總苷活性成分的篩選

刺五加根莖的主要活性成分為酚苷類化合物，通過文獻(xiàn)檢索選取刺五加總苷中含量較高的苷類成分，使用PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/）檢索得到各成分簡化分子線性輸入規(guī)范（simplified molecular-input line-entry system，SMILES）。

1.2 刺五加總苷活性成分作用靶點(diǎn)的預(yù)測

Swiss Target Prediction（http://www.swisstarget- prediction.ch/）是一種基于已知配體的2D、3D相似性度量的組合來預(yù)測小分子靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)平臺[19]。輸入SMILES式，并將屬性設(shè)置為“homo sapiens”，獲得所選成分潛在靶點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果。

1.3 抗疲勞靶點(diǎn)篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards. org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org）、DiGseE（http://210.107.182.61/geneSearch/）數(shù)據(jù)庫中搜索“fatigue”“anti-fatigue”，獲得與疲勞相關(guān)的基因，合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫的查找結(jié)果并刪除重復(fù)靶點(diǎn)，所得靶點(diǎn)即為抗疲勞作用的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 “活性成分-抗疲勞作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將刺五加活性成分作用靶點(diǎn)和抗疲勞靶點(diǎn)的篩選結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建“刺五加總苷活性成分-抗疲勞作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中，關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)用節(jié)點(diǎn)表示，節(jié)點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系用邊表示。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

String（https://string-db.org/）是用來分析蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫，可進(jìn)一步研究刺五加總苷抗疲勞的作用機(jī)制[20]。將得到的抗疲勞靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)庫，限定研究物種為“homo sapiens”，將最低相互作用評分設(shè)置為最高等置信度（highest confidence）＝0.900，隱藏沒有相互聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，獲得蛋白互作關(guān)系，導(dǎo)出數(shù)據(jù)文件，保留文件中節(jié)點(diǎn)1、節(jié)點(diǎn)2、連接評分?jǐn)?shù)據(jù)，并導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件中，設(shè)置參數(shù)使節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺反映度值大小，邊的粗細(xì)反映結(jié)合率評分高低，建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 作用靶點(diǎn)類型歸屬

DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http://www.disgenet.org/web/ DisGeNET/menu）是包含與人類疾病相關(guān)的基因和變體的平臺之一。在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中選用基因檢索的方式，將刺五加活性成分的作用靶點(diǎn)依次導(dǎo)入到數(shù)據(jù)庫中，獲得靶點(diǎn)類型信息。

1.7 分子對接驗(yàn)證

將核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，并用臨床治療藥物三磷酸腺苷二鈉（ATP-2Na）進(jìn)行對照分析[21]。首先通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲得化合物的3D結(jié)構(gòu)，并利用Open Babel 2.3.2軟件將獲得的SDF文件轉(zhuǎn)化為PDB格式。從PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb）獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)PDB格式，運(yùn)用PyMOL 2.3.4軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、去配體等操作，使用AutoDock 4.2.6軟件對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行加氫和計(jì)算電荷處理，將化合物和靶蛋白格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，利用AutoDock Vina 1.1.2軟件進(jìn)行對接，對結(jié)果進(jìn)行分析處理。

1.8 生物過程與通路分析

生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID，https://david. ncifcrf.gov/summary.jsp）作為最權(quán)威的數(shù)據(jù)庫，可提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息。將刺五加總苷的抗疲勞靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，標(biāo)識符設(shè)置為“official gene symbol”，列表類型設(shè)置為“gene list”，限定物種為“homo sapiens”。對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分析，以研究刺五加總苷抗疲勞的主要生物功能；進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，以研究刺五加總苷抗疲勞的主要信號通路。設(shè)定＜0.05，并按照值由小到大進(jìn)行排序，選取前15條生物過程或通路，進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 刺五加總苷抗疲勞活性成分的篩選

通過文獻(xiàn)檢索選取刺五加總苷中含量較高的苷類成分[22]，分別為刺五加苷A（eleutheroside A）、刺五加苷B（eleutheroside B）、刺五加苷B1（eleutheroside B1）、刺五加苷C（eleutheroside C）、刺五加苷D（eleutheroside D）、刺五加苷E（eleutheroside E）、芝麻素（sesamin），為刺五加根莖總苷的主要活性成分。因此，本研究選擇以上7種苷類成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

2.2 “活性成分-抗疲勞作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測7種活性成分作用靶點(diǎn)共154個(gè)，由GeneCards、OMIN、DiGseE數(shù)據(jù)庫篩選得到疲勞/抗疲勞靶點(diǎn)4955個(gè)，取交集得到刺五加總苷抗疲勞靶點(diǎn)83個(gè)。借助Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“活性成分-抗疲勞靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)中共有90個(gè)節(jié)點(diǎn)（化合物7個(gè)、靶點(diǎn)83個(gè)），115條相互作用的邊，內(nèi)圈代表刺五加總苷的活性成分，外圈代表這些活性成分對應(yīng)的抗疲勞靶點(diǎn)，邊代表兩者的相互作用。度值較高的化合物刺五加苷B、刺五加苷B1、刺五加苷C可能是刺五加總苷抗疲勞的核心成分。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

如圖2所示，圖中節(jié)點(diǎn)表示靶蛋白，邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)，網(wǎng)絡(luò)圖中共涉及60個(gè)節(jié)點(diǎn)、120條邊。節(jié)點(diǎn)越大，度值越大；邊越粗表明連接評分越高。PPI網(wǎng)絡(luò)中度值的平均值為4，節(jié)點(diǎn)緊密度的平均值為0.33，節(jié)點(diǎn)介度的平均值為0.07。經(jīng)篩選，度值、節(jié)點(diǎn)緊密度、節(jié)點(diǎn)介度均大于平均值的靶點(diǎn)有4個(gè)，分別為熱休克蛋白90α家族A級成員1（heat shock protein 90 α family class A member 1，HSP90AA1）、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9），提示它們可能是刺五加活性成分發(fā)揮抗疲勞作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。將以上關(guān)鍵靶點(diǎn)依次導(dǎo)入DisGeNET數(shù)據(jù)庫，獲取靶點(diǎn)對應(yīng)的類型，基本信息見表1。結(jié)果表明，刺五加抗疲勞過程中有蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、酶等物質(zhì)的參與。

圖1 刺五加總苷“活性成分-抗疲勞靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 刺五加總苷抗疲勞靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

2.4 分子對接驗(yàn)證

核心成分、ATP-2Na與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果見表2。一般認(rèn)為結(jié)合能小于0，化合物與蛋白可自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能越低，發(fā)生作用的可能性越大。分子對接結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所預(yù)測的核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)均可自發(fā)結(jié)合，且與ATP-2Na結(jié)合能力相近，證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果的可靠性。其中，核心成分刺五加苷B、刺五加苷B1與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能均≤?20.9 kJ/mol，與蛋白HSP90AA1的結(jié)合能力強(qiáng)于ATP-2Na，表明這兩個(gè)化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合活性更好[23]，其與關(guān)鍵蛋白之間的相互作用見圖3。

表1 刺五加總苷抗疲勞關(guān)鍵靶點(diǎn)的基本信息

2.5 GO功能富集分析

GO分析分為生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）3個(gè)部分，共同描述基因產(chǎn)物的功能。借助DAVID數(shù)據(jù)庫對刺五加總苷發(fā)揮抗疲勞作用的83個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，設(shè)定＜0.05，共獲得250條生物過程或通路，其中175個(gè)與BP相關(guān)、51個(gè)與MF相關(guān)、24個(gè)與CC相關(guān)。根據(jù)值從小到大排序，選取前15條GO條目，利用Omicshare數(shù)據(jù)庫（http://www. omicshare.com/）繪制高級氣泡圖，如圖4～6所示。氣泡表示富集在該條GO條目上的基因個(gè)數(shù)，氣泡越大，表示富集在該條GO條目上的基因個(gè)數(shù)越多。如圖4所示，靶點(diǎn)主要涉及藥物反應(yīng)（response to drug）、細(xì)胞增殖的正調(diào)控（positive regulation of cell proliferation）、MAP激酶活性的正調(diào)控（positive regulation of MAP kinase activity）、缺氧反應(yīng)（response to hypoxia）等生物過程。體內(nèi)短暫缺氧，糖酵解過程增強(qiáng)，產(chǎn)生大量乳酸、尿素等代謝產(chǎn)物，從而產(chǎn)生疲勞[24]。刺五加總苷抗疲勞的作用機(jī)制可能是通過增強(qiáng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)的攝氧能力，從而改變機(jī)體供能方式，延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生。如圖5所示，靶點(diǎn)主要集中于藥物結(jié)合（drug binding）、多巴胺結(jié)合（dopamine binding）、金屬內(nèi)肽酶活性（metalloendopeptidase activity）、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（neurotransmitter receptor activity）等分子功能。多巴胺（dopamine，DA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)之一，可通過調(diào)節(jié)情緒從而緩解疲勞。徐明等[25]研究表明，在運(yùn)動(dòng)過程中保持DA的合成與代謝，可延遲疲勞發(fā)生。如圖6所示，靶點(diǎn)主要涉及質(zhì)膜（plasma membrane）、胞液（cytosol）、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)（proteinaceous extracellular matrix）等細(xì)胞組分。關(guān)鍵靶點(diǎn)HSP90AA1可在胞液中維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞保護(hù)功能[26]。

2.6 KEGG通路富集分析

KEGG分析共獲得36條通路（＜0.05），按照值從小到大篩選出前15條通路，利用GraphPad Prism 7繪圖，如圖7所示。主要通路有鈣信號通路（calcium signaling pathway）、缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號通路（HIF-1 signaling pathway）、胰島素信號通路（insulin signaling pathway）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等，涉及淀粉、蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）和氮代謝（nitrogen metabolism）等，涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用和鈣離子信號傳導(dǎo)途徑，具體信息見表3。HIF-1信號通路與無氧運(yùn)動(dòng)引起的細(xì)胞缺氧應(yīng)激有關(guān)，可導(dǎo)致乳酸等代謝物質(zhì)堆積，產(chǎn)生疲勞感[27]；胰島素信號通路與疲勞關(guān)系密切，運(yùn)動(dòng)中胰島β細(xì)胞分泌胰島素減少，肌肉群收縮，胰島素?cái)z取量增多，胰島素可促進(jìn)運(yùn)動(dòng)過程中的脂質(zhì)代謝，抑制肝臟糖異生，從而促進(jìn)運(yùn)動(dòng)中的能量供應(yīng)[28]。

圖6 CC富集分析

3 討論

《本草綱目》中記載刺五加“久服輕身耐老”，與現(xiàn)代藥理學(xué)研究中刺五加的抗疲勞作用密切相關(guān)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)體現(xiàn)了中醫(yī)辨證的特點(diǎn)和中藥治療的整體觀，有助于多層次地闡明藥物的作用機(jī)制。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，借助相關(guān)數(shù)據(jù)庫和軟件對刺五加總苷抗疲勞的核心成分與作用機(jī)制進(jìn)行了科學(xué)探討。

“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)表明刺五加總苷抗疲勞具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，PPI網(wǎng)絡(luò)表明刺五加總苷的靶蛋白之間相互關(guān)聯(lián)，共同發(fā)揮作用。7種苷類成分均具有抗疲勞作用，其中刺五加苷B、刺五加苷B1、刺五加苷C的度值較高，可能是刺五加總苷發(fā)揮抗疲勞作用的核心成分。HSP90AA1、STAT3、VEGFA、MMP9為刺五加總苷抗疲勞的關(guān)鍵靶點(diǎn)，分子對接結(jié)果顯示，核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)均可自發(fā)結(jié)合，且與臨床藥物ATP-2Na結(jié)合能力相近，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果一致。刺五加苷B、刺五加苷B1與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合活性更高，與蛋白HSP90AA1的結(jié)合能力強(qiáng)于ATP-2Na。研究表明，刺五加苷B可明顯減輕高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對大鼠肝臟、心肌等的損傷，有利于減少含氮化合物的分解代謝供能，可延緩機(jī)體運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生并促進(jìn)疲勞的消除[29]。骨骼肌細(xì)胞中的酶、激素和其他相關(guān)因子的變化對疲勞的產(chǎn)生和恢復(fù)有重要的影響，刺五加苷B可促進(jìn)骨骼生成，其分子機(jī)制可能與核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）、PI3K/Akt信號通路有關(guān)[30-31]。有關(guān)刺五加苷B1、刺五加苷C的抗疲勞作用報(bào)道較少，本研究可為2個(gè)化合物的抗疲勞作用研究提供科學(xué)依據(jù)。

長時(shí)間的運(yùn)動(dòng)會(huì)產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基，破壞肌細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，導(dǎo)致膜上一些重要的蛋白質(zhì)失活，從而影響肌細(xì)胞膜的正常功能[32]。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一類高度保守的蛋白質(zhì)，參與多種生物過程，HSP90AA1作為家族的重要成員，可通過其C末端結(jié)構(gòu)域嵌入脂質(zhì)雙層中，在應(yīng)激條件下對膜穩(wěn)定具有重要作用[33]。白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）是由輔助T細(xì)胞2（T helper 2，Th2）、CD4＋T等多種適應(yīng)性免疫細(xì)胞分泌的一種多效價(jià)細(xì)胞因子，可促進(jìn)運(yùn)動(dòng)性疲勞的恢復(fù)，其表達(dá)受STAT3調(diào)控[34-35]。VEGFA是血小板衍生生長因子家族的成員，可增強(qiáng)血管通透性，缺血/缺氧條件下通過誘導(dǎo)VEGFA表達(dá)可促進(jìn)血管生成，對組織含氧量的恢復(fù)和器官功能的修復(fù)具有重要意義[36]。Ca2+過量蓄積可抑制線粒體呼吸，使三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成下降，導(dǎo)致肌肉疲勞[32]。金屬蛋白酶是可降解細(xì)胞外基質(zhì)的具有鈣、鋅依賴性的內(nèi)源性蛋白酶家族，MMP9是家族中重要一員，其結(jié)構(gòu)中存在與結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的鈣離子和鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，其表達(dá)可能與疲勞有關(guān)。

GO功能分析結(jié)果表明，刺五加總苷抗疲勞廣泛涉及細(xì)胞過程，物質(zhì)、能量代謝過程，對應(yīng)激的應(yīng)答等多種生物學(xué)過程，且包括神經(jīng)遞質(zhì)、金屬離子、蛋白等多種物質(zhì)的參與，表明了疲勞發(fā)生機(jī)制的復(fù)雜性。KEGG富集分析表明，刺五加總苷抗疲勞過程中主要通路有HIF-1、Ca2＋、PI3K-Akt、癌癥、胰島素信號通路，且與氮代謝、淀粉和蔗糖代謝等物質(zhì)代謝過程有關(guān)。HIF-1是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的蛋白性調(diào)節(jié)因子，運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體組織細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性缺氧，骨骼肌中HIF-1α蛋白和基因表達(dá)顯著上升[37]。運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生過量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激，引起肌肉疲勞，PI3K-Akt通路可調(diào)節(jié)糖代謝和脂肪代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的重要通路[38]。抑制PI3K/Akt通路會(huì)使HIF-1活性降低，表明PI3K/Akt通路可能參與HIF-1活化[39]。運(yùn)動(dòng)時(shí)離子代謝的紊亂，也會(huì)導(dǎo)致疲勞的產(chǎn)生。研究表明，大鼠急性運(yùn)動(dòng)后線粒體Ca2＋含量增加，ATP水平下降，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加強(qiáng)，促進(jìn)疲勞的發(fā)生，提示鈣離子通路的調(diào)節(jié)對機(jī)體抗疲勞具有重要意義。刺五加總苷主要通過作用于細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等過程共同發(fā)揮抗疲勞作用。

綜上所述，刺五加總苷抗疲勞的作用是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用來實(shí)現(xiàn)的。本研究預(yù)測的潛在活性成分、靶點(diǎn)、生物功能和通路與文獻(xiàn)報(bào)道基本符合，分子對接結(jié)果驗(yàn)證了預(yù)測的核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，表明本研究的預(yù)測較為準(zhǔn)確可靠，可從分子層面為闡釋刺五加“久服輕身耐老”的抗疲勞作用機(jī)制提供一定理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)，課題組后續(xù)將進(jìn)一步對相關(guān)靶點(diǎn)和通路進(jìn)行驗(yàn)證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 周寶寬. 中醫(yī)對疲勞的認(rèn)識 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2007, 25(11): 2385-2387.

[2] 徐藝園, 王凱, 王佳音, 等. 疲勞產(chǎn)生相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新, 2019, 24(23): 50-51.

[3] Saha A K, Schmidt B R, Wilhelmy J,. Red blood cell deformability is diminished in patients with chronic fatigue syndrome [J]., 2019, 71(1): 113-116.

[4] Morris G, Maes M. Mitochondrial dysfunctions in myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome explained by activated immuno-inflammatory, oxidative and nitrosative stress pathways [J]., 2014, 29(1): 19-36.

[5] Miwa K, Fujita M. Small heart with low cardiac output for orthostatic intolerance in patients with chronic fatigue syndrome [J]., 2011, 34(12): 782-786.

[6] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 215.

[7] 陳士林, 林余霖. 中草藥大典: 原色中草藥植物圖鑒[M]. 北京: 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社, 2006: 309.

[8] 潘景芝, 金莎, 崔文玉, 等. 刺五加的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展 [J]. 食品工業(yè)科技, 2019, 40(23): 353-360.

[9] Huang L Z, Huang B K, Ye Q,. Bioactivity-guided fractionation for anti-fatigue property of[J]., 2011, 133(1): 213-219.

[10] Zhang X L, Ren F, Huang W,. Anti-fatigue activity of extracts of stem bark from[J]., 2010, 16(1): 28-37.

[11] 涂正偉, 周渭渭, 單淇, 等. 刺五加的研究進(jìn)展[J]. 藥物評價(jià)研究, 2011, 34(3): 213-216.

[12] 曲中原. 刺五加總苷抗疲勞實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 中成藥, 2009, 31(3): 474-476.

[13] 王萍, 唐仕歡, 蘇瑾, 等. 基于整合藥理學(xué)的中藥現(xiàn)代研究進(jìn)展 [J]. 中國中藥雜志, 2018, 43(7): 1297-1302.

[14] 王樂琪, 張?jiān)品? 李莎莎, 等. 丹參治療微循環(huán)障礙作用機(jī)制的“成分-靶點(diǎn)-通路”多層次互作網(wǎng)絡(luò)模型研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(2): 439-450.

[15] 鄭義蕾, 王瀟, 劉芳, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的厚樸“發(fā)汗”科學(xué)內(nèi)涵探究 [J]. 中草藥, 2019, 50(8): 1857-1862.

[16] Zhang G B, Li Q Y, Chen Q L,. Network pharmacology: A new approach for Chinese herbal medicine research [J]., 2013, 2013: 621423.

[17] 解靜, 高杉, 李琳, 等. 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥領(lǐng)域中的研究進(jìn)展與應(yīng)用策略 [J]. 中草藥, 2019, 50(10): 2257-2265.

[18] Li S, Ding Q Y. New progress of interdisciplinary research between network toxicology, quality markers and TCM network pharmacology [J]., 2019, 11(4): 347-348.

[19] Gfeller D, Grosdidier A, Wirth M,. Swiss target prediction: A web server for target prediction of bioactive small molecules [J]., 2014, 42: W32-W38.

[20] von Mering C, Jensen L J, Snel B,. STRING: Known and predicted protein-protein associations, integrated and transferred across organisms [J]., 2005, 33: D433-D437.

[21] 欒海云, 楊清寶, 楊茗, 等. 左卡尼汀通過改變小鼠乳酸和糖原含量延緩疲勞的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 中國新藥雜志, 2019, 28(8): 1017-1020.

[22] 高彥宇, 李文慧, 寇楠, 等. 刺五加化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 中醫(yī)藥信息, 2019, 36(2): 113-116.

[23] 朱曉芹, 劉志強(qiáng), 王博龍. 基于生物分子網(wǎng)絡(luò)和分子對接研究槲皮素抗宮頸癌的機(jī)制 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2020, 32(1): 23-31.

[24] 潘翔, 徐峰. 刺五加抗疲勞功能實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)展 [J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理, 2005, 22(2): 39-43.

[25] 徐明, 蔡國梁, 李若愚. 運(yùn)動(dòng)性疲勞分子生物學(xué)機(jī)制的研究進(jìn)展 [J]. 成都體育學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 31(4): 91-94.

[26] Stebbins C E, Russo A A, Schneider C,. Crystal structure of an Hsp90-geldanamycin complex: Targeting of a protein chaperone by an antitumor agent [J]., 1997, 89(2): 239-250.

[27] Le Moine C M, Morash A J, McClelland G B. Changes in HIF-1α protein, pyruvate dehydrogenase phosphorylation, and activity with exercise in acute and chronic hypoxia [J]., 2011, 301(4): R1098-R1104.

[28] 阮亦, 王歡, 顧偉, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的莧參合劑抗運(yùn)動(dòng)性疲勞作用機(jī)制研究 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2019, 37(3): 650-655.

[29] 吳麗群, 葉齊, 齊荔紅. 刺五加苷B抗運(yùn)動(dòng)性疲勞作用的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 西北藥學(xué)雜志, 2013, 28(1): 50-53.

[30] 趙星龍, 吳曉光, 尹瑞欣. 運(yùn)動(dòng)性疲勞與肝臟、骨骼肌細(xì)胞的關(guān)系研究進(jìn)展 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2016, 12(19): 59-63.

[31] Liu J, Zhang Z, Guo Q,. Syringin prevents bone loss in ovariectomized mice via TRAF6mediated inhibition of NF-κB and stimulation of PI3K/AKT [J]., 2018, 42: 43-50.

[32] Lamb G D, Stephenson D G. Effects of intracellular pH and Mg2＋on excitation-contraction coupling in skeletal muscle fibres of the rat [J]., 1994, 478(2): 331-339.

[33] Li P P, Wang J J, Zou Y,. Interaction of Hsp90AA1 with phospholipids stabilizes membranes under stress conditions [J]., 2019, 1861(2): 457-465.

[34] Govender U, Corre B, Bourdache Y,. Type I interferon-enhanced IL-10 expression in human CD4＋T cells is regulated by STAT3, STAT2, and BATF transcription factors [J]., 2017, 101(5): 1181-1190.

[35] 陳英松, 盧峻, 吳七柱, 等. 艾灸對疲勞模型大鼠血清IL-6和IL-10的影響 [J]. 山東中醫(yī)雜志, 2008, 27(6): 404-405.

[36] 張學(xué)弟, 孫慧林, 高連澤, 等. 長鏈非編碼RNA在器官缺血/缺氧誘導(dǎo)血管生成中作用研究進(jìn)展 [J]. 中華實(shí)用診斷與治療雜志, 2020, 34(2): 207-209.

[37] 郝少偉. 高原低氧環(huán)境大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后增壓輔助方法對大鼠骨骼肌中HIF-1α及骨骼肌能量代謝的影響 [D]. 西寧: 青海師范大學(xué), 2014.

[38] 吳麗君, 趙靜, 孫卓, 等. 運(yùn)動(dòng)氧化應(yīng)激與PI3K-Akt通路研究進(jìn)展 [J]. 體育研究與教育, 2019, 34(2): 1-5.

[39] 張榮天, 雷鳴, 劉偉, 等. Hif-1α及ERK信號通路在缺血再灌注損傷組織中的表達(dá)研究現(xiàn)狀 [J]. 世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘, 2015, 15(19): 23-24.

Anti-fatigue mechanism ofglycosides based on network pharmacology

GAO Han1, XU Wei1, ZHANG Yu-hang1, QIU Zhi-dong1, FU Chao-mei2, QI Xiao-na3, JIA Ai-ling1, 2

1. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Active Ingredient of Ministry of Education, School of Pharmaceutical Sciences, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China 2. School of Pharmaceutical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 3. Department of Obstetrics and Gynecology, Affiliated Hospital of Beihua University, Jilin 132000, China

To explore the anti-fatigue mechanism ofglycosides based on network pharmacology.Seven main components inglycosides were used as research objects. Swiss Target Prediction was used to predict the potential targets of these components. The related targets of anti-fatigue were provided by GeneCards, OMIM, DiGseE databases, and Cytoscape 3.7.2 software was used to construct the active ingredients-anti-fatigue target network. Core components were selected by degree value. The protein interaction network (PPI) was constructed by String platform and Cytoscape 3.7.2. Key targets were selected by degree value, closeness, and betweenness, and the type of targets were attributed by DisGeNET database. AutoDock vina software was used to dock the molecules of the core components with the key targets. The geneontology (GO) andKyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathways involved in the targets were analyzed by DAVID database.A total of seven active components including eleutheroside A, eleutheroside B, eleutheroside B1, eleutheroside C, eleutheroside D, eleutheroside E, sesamin and 83 targets ofglycosides were involved, three core components including eleutheroside B, eleutheroside B1 and eleutheroside C, four key targets including heat shock protein 90 α family class A member 1 (HSP90AA1), signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), vascular endothelial growth factor A (VEGFA), and matrix metalloproteinase 9 (MMP9) were screened. Molecular docking showed that the binding ability of the core components to the key targets was close to that of ATP-2Na. After gene enrichment analysis, 250 GO terms (< 0.05) and 36 KEGG pathways (< 0.05) were obtained. The results showed that the process of response to drug, positive regulation of cell proliferation, response to hypoxia were mainly involved by adjusting the HIF-1, PI3K-Akt, insulin signaling pathway and material metabolism to exert its anti-fatigue effect.Main targets and related pathways of anti-fatigue effects ofglycosides were preliminarily investigated, which provided scientific basis and reference for study of anti-fatigue mechanism of.

glycosides; anti-fatigue; network pharmacology; eleutheroside B; eleutheroside B1; eleutheroside C

R285.5

A

0253 - 2670(2021)02 - 0413 -09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.014

2020-07-22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81973712）；吉林省發(fā)改委項(xiàng)目（2020C007）；吉林省科技廳項(xiàng)目（20200602034ZP）

高 寒（1995—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬镄聞┬团c新技術(shù)研究。E-mail: 2353731484@qq.com

賈艾玲（1986—），女，博士研究生，副教授，研究方向?yàn)橹饕獜氖轮兴幹苿┭芯?。E-mail: cczyyjal@163.com

徐 偉（1980—），男，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴幹苿┬录夹g(shù)及中藥新藥開發(fā)研究。E-mail: 1272349594@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]