邵寬芙蓉 關(guān)鳳軍 董晨

（徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇徐州 221000）

過敏性紫癜（Henoch-Sch?nlein purpura, HSP）屬于自身免疫反應(yīng)所介導(dǎo)的全身性血管炎，HSP患者中有30%～50%累及腎臟，出現(xiàn)血尿、蛋白尿[1]，稱為紫癜性腎炎（Henoch-Sch?nlein purpura nephritis, HSPN），多發(fā)生于起病1 個月內(nèi)。該病容易復(fù)發(fā)[2],預(yù)后取決于腎臟受累程度。本病發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，已有研究證明Th1/Th2、Th17/Treg 細(xì)胞失衡在HSP 發(fā)病機(jī)制中占有重要作用[3-4]。而近期發(fā)現(xiàn)了一種不同于Th1、Th2 細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞亞群[5]，稱為濾泡輔助性T（follicular helper T,Tfh）細(xì)胞，具有輔助B 細(xì)胞活化成熟的功能[6]，同時(shí)表達(dá)PD-1、CXCR5、ICOS 等表面分子[7]，通過產(chǎn)生IL-21、IL-4 刺激B 細(xì)胞分化并促進(jìn)抗體類別轉(zhuǎn)換。目前越來越多的證據(jù)支持Tfh 細(xì)胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Graves 病等各種自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用[8]。有研究表明[9]，Tfh 細(xì)胞參與了兒童HSP 的發(fā)病，且與HSPN 的腎臟損害存在一定聯(lián)系。

HSPN 持續(xù)的蛋白尿可導(dǎo)致腎小管間質(zhì)損害，α1 微球蛋白（A1M）是相對分子質(zhì)量為30 000 的糖蛋白，特異性好，僅在腎小管損傷時(shí)排出明顯增加[10]。血清胱抑素C（CysC）作為一種分泌性蛋白，產(chǎn)生率相對恒定，通過腎小球?yàn)V過排泄，之后被近曲小管重吸收并迅速分解代謝，不再重回血液循環(huán)，因此CysC 常被用于評估腎功能。

CysC 和A1M 可作為判斷腎臟損害程度的指標(biāo)[11]，聯(lián)合檢測兩者能更好地判斷腎臟損害程度。對于HSPN 患兒，目前主要是通過藥物，如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等進(jìn)行治療，但其副作用較大，療效欠佳。白芍總苷（total glucoside of paeony,TGP）作為一種中成藥制劑，通過調(diào)節(jié)自身免疫疾病患者的細(xì)胞免疫、體液免疫及炎癥過程，起到抑制和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗炎等作用[12]。近年來，在應(yīng)用TGP 治療HSPN 時(shí)取得了較好的臨床療效和較高的用藥安全性[13]，但其確切的作用機(jī)制尚未明確。因此探討TGP 治療HSPN 的臨床療效及對Tfh 細(xì)胞、IL-21、IL-4 表達(dá)的影響，為今后TGP 更好地應(yīng)用于臨床提供一定的理論依據(jù)，為兒童HSPN 的治療及對腎臟損害的改善提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2019 年1 月至2020 年1 月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的中度蛋白尿型HSPN 患兒共64 例作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）初發(fā)病例；（2）診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會腎臟學(xué)組制定的《紫癜性腎炎診治循證指南（2016）》[14]；（3） 伴有中度蛋白尿[24 h 尿蛋白定量為25～50 mg/(kg·d)]，無血尿；（4）近2 周未使用過糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺等影響免疫功能的藥物；（5）既往無腎臟疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病或自身免疫性疾病等相關(guān)病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜3歲或年齡＞12 歲者；（2）有嚴(yán)重肝腎功能障礙者；（3）有明確對本試驗(yàn)中使用藥物成分有禁忌者。通過預(yù)調(diào)查及樣本量估算公式，計(jì)算得出每組需納入27 例。采用隨機(jī)數(shù)字表法將64 例患兒分成TGP 治療組（TGP 組，n=34）和常規(guī)治療組（常規(guī)組，n=30）；另選取同期于我院門診行健康體檢兒童30 例作為健康對照組，既往無腎臟及自身免疫性疾病史。所有入組兒童家長均已簽署知情同意書，本研究已獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（XYFY2019-KL062-01）。

1.2 方法

HSPN 兩組患兒入院后，予常規(guī)治療。在此基礎(chǔ)上TGP 組加用TGP 膠囊（寧波立華制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20055060，規(guī)格：0.3 g/粒），用量：30 mg/(kg·d)，分2 次口服，最大劑量不超過1.8 g/d，口服4 周。

1.3 監(jiān)測指標(biāo)

清晨采集健康對照組兒童空腹肘靜脈血，以及HSPN 兩組患兒在治療前及治療4 周后空腹肘靜脈血約4 mL 置于肝素抗凝試管中，并將其分為Ⅰ、Ⅱ兩管（各2 mL）。Ⅰ管離心后（3 000 r/min，10 min）留取血漿，采用ELISA 抗體夾心法檢測血漿中IL-21、IL-4 的濃度，試劑盒購自康美生物科技有限公司，操作步驟遵循試劑盒說明書。Ⅱ管加入抗CD4（FITC）和抗PD-1（PE）抗體；再加入混勻的50 μL 待測樣品，混勻后室溫避光孵育30 min；用紅細(xì)胞裂解液，37℃水溶約10 min，待完全溶血后，BSB 洗1 次，定義CD4+PD-1+細(xì)胞群為Tfh 細(xì)胞群，流式細(xì)胞術(shù)分析外周血CD4+PD-1+Tfh 細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞比例。采用乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測患兒血清中CysC 水平，采用放射免疫分析法測定尿A1M 水平。以上由徐州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)中心完成。

1.4 療效判斷

根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]進(jìn)行療效判定。痊愈：紫癜、腹痛等全身癥狀與體征消失，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)恢復(fù)正常；顯效：全身癥狀與體征較前明顯減輕，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)較前有所改善；無效：全身癥狀、體征及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均無變化或惡化。治療總有效率=（痊愈例數(shù)+顯效例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，同組治療前后比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，兩組間數(shù)據(jù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

HSPN 組與健康對照組、常規(guī)組與TGP 組在年齡、性別方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1～2。

2.2 HSPN 組與健康對照組外周血中Tfh 細(xì)胞及IL-21、IL-4 水平測定

HSPN 患兒治療前Tfh 細(xì)胞比例及血漿IL-21、IL-4 細(xì)胞因子表達(dá)水平均較健康對照組明顯升高（P＜0.01），見表3 及圖1。

表1 HSPN 組與健康對照組一般臨床資料的比較

表2 常規(guī)組與TGP 組一般臨床資料的比較

表3 健康對照組與HSPN 組治療前Tfh 細(xì)胞比例及IL-21、IL-4 水平比較 （±s,）

表3 健康對照組與HSPN 組治療前Tfh 細(xì)胞比例及IL-21、IL-4 水平比較 （±s,）

組別 例數(shù) Tfh 細(xì)胞比例(%)IL-21(pg/mL)IL-4(pg/mL)健康對照組 30 24.53±0.22 131±5 19.5±1.6 HSPN 組 64 32.01±0.27 250±6 40.6±1.5 t 值 -133.543 -96.492 -63.595 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖1 健康兒童與HSPN 患兒治療前外周血Tfh 細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的比例 Q2 象限示Tfh 細(xì)胞比例。

2.3 相關(guān)性分析

HSPN 患兒治療前外周血中Tfh 細(xì)胞比例與IL-21 水平呈顯著正相關(guān)（r=0.766，P＜0.0001）。同時(shí)，治療前血漿中IL-4 水平與Tfh 細(xì)胞比例及與IL-21 水平亦呈正相關(guān)（分別r=0.437、0.401，P＜0.01），見圖2。

圖2 HSPN 患兒治療前Tfh 細(xì)胞比例及IL-21、IL-4 水平相關(guān)性分析圖

2.4 臨床療效及不良反應(yīng)比較

兩組患兒治療結(jié)束后，TGP 組的總有效率明顯高于常規(guī)組（P＜0.05，表4）。兩組患兒在治療期間均未發(fā)生嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)；治療期間血常規(guī)、肝腎功能等檢查均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。

表4 兩組患兒臨床療效 [例（%）]

2.5 兩組患兒治療前后Tfh 細(xì)胞比例及IL-21、IL-4 水平變化

兩組患兒經(jīng)過治療后，Tfh 細(xì)胞比例及IL-21、IL-4 水平均較治療前顯著下降（P＜0.01）。治療后的TGP 組患兒外周血Tfh 細(xì)胞比例及IL-21、IL-4 水平均顯著低于常規(guī)組（P＜0.01）。見圖3 及表5。

2.6 兩組患兒治療前后血清CysC 及尿A1M 水平變化

兩組患兒經(jīng)過治療后血清CysC 及尿A1M 水平均較治療前明顯下降（P＜0.01），而TGP 組患兒較常規(guī)組下降更為顯著（P＜0.01），見表6。

圖3 常規(guī)組與TGP 組患兒治療4 周后外周血Tfh 細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的比例 Q2 象限示Tfh 細(xì)胞比例。

表5 兩組患兒治療前后Tfh 細(xì)胞比例及IL-21、IL-4 水平比較 （±s,）

表5 兩組患兒治療前后Tfh 細(xì)胞比例及IL-21、IL-4 水平比較 （±s,）

組別 例數(shù) Tfh 細(xì)胞比例(%) IL-21 (pg/mL)治療前 治療后 t 值 P 值 治療前 治療后 t 值 P 值常規(guī)組 30 32.03±0.28 27.64±0.29 84.365 ＜0.01 249±5 184±6 69.057 ＜0.01 TGP 組 34 31.99±0.25 26.05±0.26 185.345 ＜0.01 251±6 154±3 134.974 ＜0.01 t 值 -0.612 -22.876 1.253 -24.983 P 值 0.543 ＜0.01 0.215 ＜0.01組別 例數(shù) IL-4 (pg/mL)治療前 治療后 t 值 P 值常規(guī)組 30 40.8±1.4 33.8±0.8 27.754 ＜0.01 TGP 組 34 40.4±1.5 26.6±1.1 54.215 ＜0.01 t 值 -0.950 -29.445 P 值 0.346 ＜0.01

表6 兩組患兒治療前后血清CysC 及尿A1M 水平比較 （±s,）

表6 兩組患兒治療前后血清CysC 及尿A1M 水平比較 （±s,）

注：[CysC] 胱抑素C；[A1M] α1 微球蛋白。

組別 例數(shù) CysC (mg/L) A1M (μg/mL)治療前 治療后 t 值 P 值 治療前 治療后 t 值 P 值常規(guī)組 30 0.77±0.13 0.58±0.07 13.304 ＜0.01 12.7±2.4 9.5±1.6 14.774 ＜0.01 TGP 組 34 0.74±0.09 0.42±0.06 26.744 ＜0.01 12.0±1.1 6.6±1.2 34.481 ＜0.01 t 值 -1.151 -9.349 -1.329 -8.224 P 值 0.254 ＜0.01 0.192 ＜0.01

3 討論

HSP 是一種自身免疫性血管炎，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。HSP 病變累及腎臟時(shí)會發(fā)展為HSPN，甚至發(fā)展為終末期腎病，是本病最嚴(yán)重的合并癥之一，故腎臟受累的嚴(yán)重程度是決定患者預(yù)后的關(guān)鍵性因素。有研究表明Tfh 細(xì)胞是抗體產(chǎn)生的真正輔助者，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[16]。Tfh 細(xì)胞異常表達(dá)可能是導(dǎo)致急性期HSP體液免疫功能紊亂的原因之一。Tfh 細(xì)胞主要通過分泌IL-21、IL-4 發(fā)揮抗炎作用。IL-21 是Tfh 細(xì)胞執(zhí)行效應(yīng)功能的主要細(xì)胞因子[17-18]，通過產(chǎn)生IL-21 等細(xì)胞因子及表達(dá)ICOS 等協(xié)同刺激分子促進(jìn)生發(fā)中心的形成、B 細(xì)胞的增殖分化及免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)化[19]。IL-4 是機(jī)體免疫反應(yīng)中重要的細(xì)胞因子，可促進(jìn)活化B 細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)B 細(xì)胞產(chǎn)生IgG1、IgE 和sIgM，調(diào)節(jié)B 細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)IgE Fc 受體，參與變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病過程。本研究顯示，HSPN 患兒外周血Tfh 細(xì)胞比例及IL-21 表達(dá)水平均較健康對照組明顯升高，同時(shí)顯示，Tfh 細(xì)胞比例與IL-21 水平呈正相關(guān)，與國內(nèi)外的報(bào)告相一致[20-21]，說明Tfh 細(xì)胞及其執(zhí)行效應(yīng)功能的細(xì)胞因子IL-21 共同參與了HSPN 的發(fā)生、發(fā)展，但其具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的探討研究。且本研究發(fā)現(xiàn)HSPN 患兒IL-4 水平高于健康對照組，IL-4 與Tfh 細(xì)胞比例及IL-21 水平亦呈正相關(guān)關(guān)系，由此猜測IL-4 也參與了HSPN 的發(fā)病過程，并且與Tfh 細(xì)胞、IL-21 關(guān)系密切。

TGP 是從中藥白芍中提取的有效成分，是一種免疫調(diào)節(jié)劑，可抑制T 淋巴細(xì)胞的活化，調(diào)節(jié)Th1/Th2 細(xì)胞亞群平衡，抑制炎癥介質(zhì)的合成及釋放，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的生成，下調(diào)炎性因子的表達(dá)水平，發(fā)揮抗炎作用。有研究表明，TGP 不僅可以起到增強(qiáng)HSPN 療效的作用，還可以有效緩解其他藥物在治療HSPN 時(shí)可能對肝、腎功能產(chǎn)生的損害[22]。本研究通過對TGP 治療中度蛋白尿型HSPN 臨床療效的觀察，發(fā)現(xiàn)TGP 組總有效率明顯高于常規(guī)組，且無嚴(yán)重不良反應(yīng)。同時(shí)，經(jīng)過治療后兩組患兒的Tfh 細(xì)胞比例及IL-21、IL-4水平均較前下降，而TGP 組患兒的Tfh 細(xì)胞比例及IL-21、IL-4 表達(dá)水平較常規(guī)組顯著下降。因此，通過下調(diào)Tfh 細(xì)胞比例從而抑制IL-21、IL-4 等炎癥因子的合成及釋放，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，可能是TGP 治療HSPN 發(fā)揮作用的主要機(jī)制之一。

目前臨床上多通過檢測患者體內(nèi)的尿素氮和血肌酐對腎功能損害程度進(jìn)行評價(jià)，但易受多種因素的影響，因此診斷效能并不高。血清CysC為半胱氨酸抑制劑家族中的一員，僅通過腎小球?yàn)V過，與尿素氮、血肌酐、尿肌酐等指標(biāo)相比，CysC 不受炎癥、發(fā)熱、免疫等疾病的影響，CysC水平越高，提示腎臟受累程度越重[23]。A1M 是腎小管重吸收功能的標(biāo)志蛋白，特異性好，正常情況下，尿中A1M 含量甚微，僅在腎小管損傷時(shí)排出明顯增加[24]。因此聯(lián)合觀察CysC 及A1M 對于判斷HSPN 早期腎功能的損傷更具有代表性。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TGP 組患兒不僅治療總有效率明顯高于常規(guī)組，而且治療后血清CysC 及尿A1M水平較常規(guī)組下降更為明顯，提示加用TGP 治療HSPN 不僅臨床療效優(yōu)于常規(guī)治療，而且可能有改善腎功能的效果，對于其改善預(yù)后可能具有一定作用。

綜上所述，Tfh 細(xì)胞及IL-21、IL-4 共同參與了HSPN 的發(fā)病機(jī)制，而TGP 臨床療效較好，不良反應(yīng)少，且可能通過對上述細(xì)胞及因子的調(diào)節(jié)作用從而在輔助治療HSPN 過程中發(fā)揮著重要作用。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。